Питательные среды
Микрофлора пива – один из важнейших факторов в пивоварении. Ни для одного пивовара не секрет, что, если вы приготовите партию пива, разделите ее на 100 порций и засеете 30 разными дрожжевыми штаммами и сбродите при разных температурах, при разном уровне (количестве) внесения дрожжевых клеток, вы получите 100 разных сортов пива. Дрожжи и бактерии в пиве придают продукту свои уникальные вкусовые качества, которые зависят от различных условий брожения. В то время как для начинающих домашних пивоваров работа с дрожжами сводится к открытию пакета и заливке его в сусло, более продвинутый любитель пива начнет собирать дрожжи, собирать дрожжевой осадок, промывать дрожжи и в конечном итоге становиться немного «домашним пивоваром – микробиологом».
Одна из самых больших проблем, с которой сталкиваются домашние пивовары- микробиологи, особенно те, кто балуется диким пивом, — это отделение штаммов дрожжей и бактерий. Эта проблема выходит далеко за рамки приготовления стартера и хранения банка замороженных дрожжей или уклонов, которые, по крайней мере, на данном этапе домашнего пивоварения, считаются одними из самых чудных микробиологических технологий, которые могут быть достигнуты на вашей кухне. Некоторые смельчаки решаются на то, чтобы оживить дрожжи из осадка бутылок, переливая их в стартер в надежде, что они не будут заражены; это работает с разной степенью успеха. И лишь немногие из тех, кто немного «ненормальный» и имеет реальную научную подготовку, доходит до изготовления чашек (Прим.пер. имеется ввиду чашки Петри и т.п.), используя различные питательные среды, ноу-хау и техники для разделения и дифференциации различных микроорганизмов.
К таким людям относятся я, Джейсон из Brew Science и Сэм из Eureka Brewing. Конечно, есть и другие, но я не имел удовольствия общаться с ними. Однако у нас, склонных к науке пивоваров, есть недостаток в том, что мы можем отклоняться от истинно «домашнего пивоварения» и немного «мошенничать», используя имеющееся в нашем распоряжении лабораторное оборудование, которое, конечно, недосягаемо для среднего пивовара.
В связи с недавним взрывом и популяризацией дикого пива домашние пивовары возглавляют фанк-движение и часто производят пиво, намного превосходящее коммерческие образцы, благодаря своей способности экспериментировать с небольшими партиями. В таких условиях для нас становится все более важным уметь различать микроорганизмы, которые мы используем. Хотя в домашних условиях различить Saccharomyces cerevisiae из Сьерра-Невады и Chimay практически невозможно, можно провести различие между Saccharomyces, Brettanomyces и бактериями.
В течение последних нескольких месяцев я пытался придумать несколько удобных для домашних пивоваров питательных сред, которые могли бы дать возможность различать микроорганизмы без особых проблем и затрат. Возможно, самым неожиданным результатом этого начинания стало то, что эксперименты в определенной степени действительно дают результаты. Хотя у меня была своя доля неудач, я чувствую, что к этому времени уже собрано достаточно хорошей информации, которой можно поделиться и помочь другим. Итак, без лишних слов, вот оно …
Формат будет следующий: название питательной среды, ее рецепт и способ приготовления, как она выглядит, и мои наблюдения за различными неудачами с этой средой. Затем я напишу несколько мыслей о том, как это исправить или что я сделал не так.
Начнем со среды на основе солода.
Солодовый экстракт / агаризированное сусло
Состав на литр:[hide]
Разбавленное сусло ………………… 1 л
Агар …………………………… 15-20 г
pH 5,2 ± 0,2 при 25 ° C
Примечание: если вы используете солодовый экстракт, добавьте 20 г DME в 1 литр воды. Плотность сусла или раствора DME должна быть около 1,002, иначе у вас будут проблемы с консистенцией агара (Прим.пер.: спорное утверждение, т.к. я лично пробовал плотность 4Р, 6Р и 10Р – все работало. Возможно, автор использовал некачественный агар, т.к. на личном опыте убедился, что от качества агара сильно зависит результат).
Приготовление среды: Добавьте компоненты в дистиллированную/деионизированную воду и доведите объем до 1,0 л. Тщательно перемешайте. Медленно нагревая доведите до кипения. Разлейте по пробиркам или колбам. Автоклавируйте в течение 15 минут при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм (1 атм.) и 121C. Автоклавируйте в скороварке. Разлейте по стерильным чашкам Петри или оставьте в пробирках (Прим. пер.: сомнительный метод: сначала автоклавируйте, а потом, откройте и перелейте в чашки Петри звучит как «стерилизуйте и потом заразите», лучше стерилизовать сразу в чашке Петри и открывать ее только для работы с культурой).
Использование: для культивирования и сохранения дрожжей и микроорганизмов, обычно связанных с пивоварением.
Внешний вид: Прозрачный, темно-золотистого цвета.
Наблюдения: на этих средах растет практически все. Невозможно отличить Saccharomyces от Brettanomyces. Микроорганизмы можно отличить по колониям разного цвета, которые они образуют. Эта среда неэффективна для дифференциации микроорганизмов, но она достаточно хорошая и дешевая для выделения отдельных колоний и поддержания вашего дрожжевого банка.
Бромокрезоловый зеленый (BG) и универсальный индикатор (UI): добавлением BG и UI вы можете изменить свойства данной питательной среды. Сначала о стабильности показателей. Я попробовал добавлять оба компонента как до, так и после «автоклавирования» и обнаружил, что BG является термостабильным и продолжает работать, в то время как UI теряет свои свойства с повышением температуры. Если еще и автоклавировать, то вряд ли результат улучшиться. Я больше не буду пробовать это ни в одной из своих сред. Чашки голубовато-зеленые. Я уже писал ранее о своем наблюдении, что BG, по-видимому, пагубно влияет на рост Lactobaillus, и это еще раз подтвердилось на моих чашках. Другими словами – Lactobacillus не растет на чашках с BG. Покопавшись, я обнаружил, что BG является членом семейства трифенилметановых красителей, которые смертельны для большинства грамположительных микроорганизмов. Это объясняет такой эффект. Что касается дифференциации Saccharomyces и Brettanomyces, кажется, что эта среда эффективна в относительно короткие сроки. В течение первых недель или двух вы можете наблюдать разницу в окраске, но после этого все колонии выглядят одинаково. При таком методе бреттаномицеты, кажется, образуют синие колонии, а сахаромицеты образуют зеленые колонии. Со временем все становится зеленовато-белым, а среда теряет окраску. В целом добавление красителя не делает среду очень дифференциально эффективной. Я предполагаю, что должен быть дополнительный источник углерода для лучшего разложения красителя. Придется повторно засеять клетки, а также попробовать тот же рецепт с добавлением сахара, чтобы прийти к более определенному выводу.
Примечания: держу пари, когда вы читали, что вам нужно разбавить сусло до 1,002, большинство из вас подумали, что я идиот и не понимает, о чем говорю. Поверьте, мне, я пробовал использовать более концентрированное сусло и больше DME, чтобы сделать красивый и сочный агар, и каждый раз, когда я это делал, мне не удавалось. Если вы не готовы потратить тонну агара на чашку с солодом, лучшее, что у вас получится, — это что-то с консистенцией яблочного соуса.
Солодовый агар с BG. Смесь дрожжей. бреттаномицетов и педиококов. 3 морфологических колонии
Переходим к моему личному фавориту – питательной среде на картофельной основе! Я говорил о картофельных средах с декстрозой и сахарозой, и следующее – продолжение тренда «переключения с сахара».
Картофельный агар с лактозой и универсальным индикатором
Состав на литр:
Картофель ………………………… 300,0 г
Лактоза …………………………. 10,0 г
Агар …………………………….. 15,0 г
Приготовление среды: нарезать картофель кубиками и поместить в 500 мл кипящей воды на 30 минут. Процедить через марлю. Доведите до объема 1,0 л с помощью дистиллированной / деионизированной воды. Тщательно перемешайте. Добавьте агар и лактозу. Слегка нагрейте и доведите до кипения. Тщательно перемешайте. Разлейте по пробиркам или колбам. Автоклавируйте в течение 15 минут при давлении 15 фунтов на кв. дюйм (1 атм.) и температуре 121C. Разлейте по стерильным чашкам Петри или оставьте в пробирках.
Использование: для выращивания и сохранения множества видов грибов (Прим.пер. в смысле микроорганизмов, к которым относятся пивные дрожжи и бреттаномицеты) и молочнокислых бактерий.
Внешний вид: Прозрачный, ярко-золотисто-желтого цвета.
Наблюдения: основная цель создания этой среды заключалась в том, чтобы увидеть, как растут молочнокислые бактерии, поскольку BG токсичен для лактобактерий, я думаю, очевидно, почему его не исползуют. Этот опыт оказался гораздо более полезным, чем простое изучение Lactobacillus, и данная среда стала моим фаворитом. В качестве контрольного штамма я использовал WY Lactobacillus delbrueckii, WY Brettanomyces B и WY Biere de Garde.
–Lactobacillus легко растет, образуя большие беловато-желтые умбонатные колонии.
–Brettanomyces B понадобилось около двух недель, чтобы выросли крошечные круглые белые колонии. Это неудивительно, потому что, как известно, Brett B не ферментирует лактозу, поэтому ему приходилось жить за счет всего, что я получил от варки картофеля (Прим.пер.: бреттаномицеты могут перерабатывать крахмал, но это занимает много времени).
-Дрожжи Biere de Garde доставили мне больше вопросов, чем ответов. Предположительно, это штамм Fantome (Прим.пер.: автор вероятно имеет ввиду дрожжи, которые он культивировал из бутылки с пивоварни Fantôme, коммерческие аналоги – ECY03 и Yeast Bay WallonianFarmhouse), известный своей сверхмощной аттенюацией, и я понимаю, почему он имеет такую репутацию. Я делал из него несколько сортов пива, и все они выбродили довольно сухо. Теперь самое интересное. Колонии дрожжей росли так же быстро, как и колонии Lactobacillus на другой стороне той же чашки, образуя белые колонии среднего размера! Я поместил на эти чашки несколько смешанных культур (из коммерческого пива, о котором я расскажу в следующих статьях), и в каждом случае Saccharomyces росли очень медленно. Я пока не могу дать объяснений, но сейчас данные указывают на то, что именно этот штамм дрожжей действительно может сбраживать лактозу. Странно? Делайте ставки!
–Педиококи образуют круглые выпуклые ярко-желтые колонии.
–Brettanomyces L, выделенный из смеси WY Old Ale Blend, дают коричневатые колонии в форме «мозга».
–Brettanomyces ??? Изолированный от WY Berliner Blend образуют те же колонии, что и его аналог из Ol Ale Blend.
В целом данная среда очень полезна для дифференциации микроорганизмов домашними пивоварами. Она позволяет четко выделить Lactobacillus и Pediococcus, различать Brett B и его собратьев, а также замедляет рост Saccharomyces в достаточной степени, чтобы позволить расти почти всем остальным микроорганизмам, прежде чем Saccharomyces начнут формировать колонии приличного размера.
Недостатки: как описано ранее, UI, похоже, не выдержал термической обработки, и добавление его впоследствии не даст никакой пользы. Я надеялся, что этот индикатор поможет определить степень образования кислоты (Прим.пер.: автор имеет ввиду, что данный компонент будет реагировать на производство кислоты различными микроорганизмами, меняя цвет на среде и тем самым помогая различать колонии различных микроорганизмов). Вместо этого в следующий раз я воспользуюсь лакмусом. Верно, старый добрый лакмус, который уже почти стерся из памяти. Вы все еще можете найти этот порошок на eBay по адекватной цене. Он термостабилен, нетоксичен и дает отличную кислотно-щелочную дифференциацию.
Картофельный агар с лактозой и универсальным индикатором. Смесь дрожжей, бреттов и педиококов. Видны 3 морфологические колонии
Potato Lactose Agar. Lactobacillus and WY BdG yeast. Weird? YES!!! Картофельный агар с лактозой. Лактобактерии и дрожжи Бир де Гард от WY. Странно? ДА!!!!
Картофельный агар с сахарозой и бромкрезоловым зеленым
Состав на литр:
Картофель ………………… 300,0 г
Сахароза …………………… .. 10,0 г
Агар ……………………………. 15,0 г
Бромкрезоловый зеленый …………
Достаточно сделать средний голубовато-зеленый цвет (~ 0,5 – 1 мл 1% раствора)
Приготовление среды: нарезать картофель кубиками и поместить в 500 мл кипящей воды на 30 минут. Процедить через марлю. Доведите до объема 1,0 л с помощью дистиллированной / деионизированной воды. Тщательно перемешайте. Добавьте агар, сахарозу и BG. Слегка нагрейте и доведите до кипения. Тщательно перемешайте. Разлейте по пробиркам или колбам. Автоклавируйте в течение 15 минут при давлении 15 фунтов на кв. дюйм (1 атм.) и температуре 121C. Разлейте по стерильным чашкам Петри или оставьте в пробирках.
Использование: для выращивания и сохранения многочисленных грибов.
Внешний вид: чистый, голубовато-зеленого цвета.
Наблюдения: как уже говорилось ранее, грамположительные бактерии (Lactobacillus и Pediococcus) не растут, в то время как дрожжи прекрасно себя чувствуют. В соответствии с предыдущими наблюдениями, Brettanomyces разрушают BG, образуя более белые колонии в форме мозга, в то время как Saccharomyces остаются голубовато-зелеными. Среда теряет цвет и становится бесцветной при прорастании бреттаномицетов примерно через 4-7 дней. Все колонии становятся зеленовато-белыми примерно через 2 недели независимо от вида. Кажется, это простой способ отличить дикие дрожжи от обычных.
Potato Sucrose with Bromcresol Green. WY Brettanomyces B. Strangely, two colony morphologies are seen. Further investigation required. Картофельный агар с дектрозой и BG. Бреттаномицеты от WY. Странно. Видны 2 морфологические колонии. Необходимы дальнейшие исследования
Лучшей средой для роста лактобактерий является лактозный агар.
Молочный агар с лактозой
Состав на 500 мл:
Молоко (цельное) ……………. 25 мл
Лактоза ………………………… .. 10 г
Агар ……………………………… 10 г
pH 7,0 ± 0,2 при 25 ° C
Примечание: также добавил около 2 г порошка для размягчения мяса и дал ему отстояться перед автоклавированием в надежде имитировать что-то, напоминающее переваривание казеина, поскольку порошок содержит протеазу и соль. См. Наблюдения.
Приготовление среды: Добавьте компоненты в дистиллированную / деионизированную воду и доведите объем до 500 мл. Тщательно перемешайте. Слегка нагрейте и доведите до кипения. Разлейте по пробиркам или колбам. Автоклавируйте в течение 15 минут при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм (1 атм) и 121 ° C. Автоклавируйте в скороварке. Дайте остыть и добавьте универсальный индикатор (Прим.пер.: риск заражения). Разлейте по стерильным чашкам Петри или оставьте в пробирках.
Использование: для культивирования и сохранения микроорганизмов из молочных продуктов и воды.
Внешний вид: Розовый, крупный, с белыми хлопьями, непрозрачный.
Наблюдения: очень пригодилось на начальных этапах охоты за микроорганизмами из йогурта и сырого сусла. Проект все еще находится на начальной стадии для последующих публикаций. Не могу сказать много об этом прямо сейчас, потому что у меня еще не было времени проконтролировать динамику роста на этих средах, но предварительные результаты с использованием йогуртов и прочего, похоже, показывают, что молочнокислые бактерии растут очень хорошо, а некоторые образуют ярко-желтые колонии, в то время как другие образуют колонии, похожие на пленки. Требуется дальнейший анализ. Из одной смешанной культуры коммерческого пива, содержащего Sacch, Brett, Lacto и, возможно, еще 2 или 3 микроорганизма, я могу сказать, что они ведут себя так же, как на Potato Lactose agar и бретаномицеты, или одна из других культур из осадка бутылки реагирует с UI и меняет цвет среды с розового до белого. Пока что кажется отличной средой для молочнокислых бактерий, потому что небактериальные виды растут очень медленно.
Недостатки: ОК, возможно, попытка протеолиза молока была не самой лучшей идеей и привела к появлению белых кусков на чашках, которые, скорее всего, были вызваны расщеплением молока. Также 25 мл молока могло быть слишком много, и чашки оказались мягкими. Не слишком мягкими, чтобы их нельзя было использовать, но все же достаточно мягкими. В следующий раз я не буду играть с размягчителем мяса и буду использовать меньше молока. Я также собираюсь добавить лакмуса, чтобы сделать классическую лакмусовую молочную среду, которая использовалась когда-то, сразу после открытия молочнокислых бактерий.
Milk Lactose Agar. 3 of the organisms isolated from raw wort. As you can see the colonies are different and one of the samples is contaminated with another organism. Молочный агар с лактозой. 3 вида микроорганизмов, изолированных из сырого сусла. Как видите колонии различаются и в одном образце произошла контаминация другим микроорганизмом.
Milk Lactose Agar. Streaked a mix from commercial dregs. So far looks like Lactobacillus is taking over everything, but other colonies also visible. You can’t really see it very well, but the agar color changes where the colonies grew. Молочный агар с лактозой. Испещрённая смесь из коммерческих осадков из бутылки. Пока похоже, что лактобактерии захватывают все, но видны и другие колонии. На самом деле не очень хорошо видно, но цвет агара меняется там, где выросли колонии.
В заключение этой статьи я расскажу о самом продвинутом агаре, который я сделал на данный момент. Недавно мне попалось около 50 мл 1% бриллиантового зеленого раствора в EtOH (его можно купить в любой восточноевропейской аптеке под названием Zelyonka (Прим.пер. 🙂 ) или Solutio Viridis nitentis spirituosa 1%). Он широко используется в качестве местного антисептика из-за того, что убивает все грамположительные и большинство грамотрицательных бактерий (конечно, как и все в биологии, есть исключения). Это делает его идеальным кандидатом для выбора, потому что он дает домашнему пивовару возможность уничтожать все бактерии в дредах (осадке из бутылки), оставляя только дрожжи, которые можно различить по морфологии колоний, ферментации лактозы и т. д. Хотя в исходном рецепте используются триптон и дрожжевой экстракт, который простые смертные не могут получить за разумную цену, я изменил его, чтобы использовать то, что доступно, и выбрал лактозу в качестве основного источника углерода в надежде снизить рост в отношении видов Brettanomyces. Почти в каждом продуктовом магазине вы можете найти бульонные кубики, которые по большей части представляют собой гидролизованные мясные и дрожжевые экстракты. Для этого эксперимента я выбрал бульонные кубики из говядины Herb Ox (~ 3,6 г каждый, содержат гидролизованную говядину и дрожжевой экстракт – хороший источник азота, углеводов, минералов и витаминов, соль – источник электролитов) и веганский овощной бульон Rapunzel без соли (~ 8 г кубиков, содержит дрожжевой экстракт и различные растительные экстракты).
Самодельный бриллиантовый зеленый агар
Состав на 500 мл:
Кубик из говядины …………………1
Овощной кубик …………… 1/2
Лактоза ………………… 10 г
Сахароза ……………… 5 г
1% раствор бриллиантового зеленого (зеленка)………. 0,6 мл
Размягчитель мяса ……… .. 2 г
Агар …………………… 10 г
pH 7,0 ± 0,2 при 25 ° C
Приготовление среды: Добавьте компоненты в дистиллированную / деионизированную воду и доведите объем до 500 мл. Тщательно перемешайте и оставьте при комнатной температуре в течение 20 минут для дальнейшего протеолиза. Слегка нагрейте и доведите до кипения. Разлейте по пробиркам или колбам. Автоклавируйте в течение 15 минут при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм (1атм) и 121 ° C. Готовьте в скороварке. Разлейте по стерильным чашкам Петри или оставьте в пробирках.
Использование: для селективного выращивания и сохранения сальмонелл и небактериальных видов.
Внешний вид: Прозрачный, зеленый с мелкими пятнышками – кусочки овощей из бульонных кубиков. Пахнет супом!
Наблюдения: как и в случае с молочным агаром, у меня еще не было времени поработать с ним должным образом. Предварительные результаты показывают, что он действительно достаточно эффективен в уничтожении бактерий. Некоторые бактериальные колонии могут выжить в тех случаях, когда я провожу столько полос, что они, вероятно, могут жить выше питательной среды, но их рост крайне ограничен. Дрожжи образуют зеленые колонии.
Добавление бромкрезолового зеленого: при добавлении BG свойства этого агара немного меняются. BG придает агару голубоватый цвет. До сих пор я не сеял чистый штамм бреттов, но я ожидал, что он вступит в реакцию с BG и «разрушит» его, как и на любой другой среде. Он действительно пригодился в качестве индикатора pH. Некоторые из организмов, которые я извлек из йогуртов и сырого сусла, похоже, выживают в зелёнке и бромкрезоловом зеленом и являются продуцентами кислоты, на что указывает желтая среда. Прямо сейчас эта среда кажется хорошим выбором для начального посева культур из осадка бутылки, поскольку она убивает бактерии, оставляя вас с различными видами Sacch и Brett. Необходим дальнейший анализ контрольных штаммов, который будет проведен в ближайшие недели.
Недостатки: Единственная проблема, с которой я сталкиваюсь с этими чашками, заключается в том, что в них есть кусочки овощей и они жирные. Вы действительно можете увидеть тонкий масляный / жировой слой на поверхности. Я уверен, что источником являются растительные масла в бульонных кубиках. На самом деле это может быть не так уж и плохо. Что касается кусочков овощей, в следующий раз я просто постараюсь лучше фильтровать среду. Когда я впервые приготовил его, вакуумная установка моего ручного насоса была недостаточно хороша для фильтрации маслянистого супа, поэтому в итоге я просто сделал среду как есть. Однако на этой неделе мне удалось приспособить мою колбу для фильтрации к пылесосу, и это должно значительно улучшить мою фильтрующую способность.
Агар с зелёнкой и BG. Те же 3 микроорганизма из сырого сусла, такие же как и и на молочном агаре. Вы можете увидеть морфологию колоний, а также изменения цвета.
Вот и все, ребята. Я думаю, что прогресс на данный момент довольно хороший, учитывая тот факт, что я по уши занят школой, лабораторией и некоторыми другими вещами, которые я хочу внедрить в свою жизнь. Я хотел бы продолжить эксперименты, но времени и денег не так много. Надеюсь, эта информация будет вам полезна и, как всегда, не стесняйтесь оставлять отзывы, предложения, вопросы, запросы и так далее. Следите за обновлениями, чтобы увидеть больше сообщений о питательных средах и изоляции микроорганизмов от коммерческих образцов пива, а также йогуртов и сырого сусла.
[/hide]
Примечание от переводчика: В качестве подтверждения “жизнеспособности” статьи, выводил дрожжи из бутылки Трипл Кармелит и затем сбродил на них партию пива, рецепт здесь.
Также к рецепту прикрепил отзывы людей, которые пробовали результат.
Также были культивированы дрожжи из следующих бутылок пива: St.Bernardus Tripel, Straffe Hendrik Quadrupel 11, Westmalle Dubbel, La Trappe Blond, De Molen “Quad Drop”. И все они ждут своего часа.
В дальнейшем планы по разделению культур на агарах из статьи из более сложного образца пива: бельгийского гёза.
Обсудим?
Автор публикации
Другие записи этого автора:
Балтийский портер. Пивоваренные традиции ...
