Лактобактерии в пиве.
Часть 2. Рост клеток, стартеры.
ЧАСТЬ 1 доступна по ссылке.
Стартеры и нормы засева
В дополнение к информации о стартерах, приведенной в предыдущей статье в разделе «Советы производителя», в этом разделе содержатся общие рекомендации по стартерам для Lactobacillus для домашних и коммерческих пивоваров. Для выращивания Lactobacillus в лабораторных условиях или из исходной группы клеток из чашки/уклона или меньшего количества клеток наиболее эффективной средой для выращивания является[hide] MRS (https://ru.qaz.wiki/wiki/MRS_agar) . Однако для полноценной нормы внесения Lactobacillus в пиво/сусло пивовары не захотят добавлять такое количество MRS в свое пиво, поскольку среда MRS имеет отчетливый аромата и запах, которые нежелательны для пива. Таким образом, размножение Lactobacillus в стартере на основе сусла рекомендуется для создания полноценной культуры Lactobacillus. Мы рекомендуем использовать колбу Эрленмейера, предназначенную для выращивания Lactobacillus, чтобы снизить вероятность заражения дрожжами. Мы также рекомендуем использовать процедуры Самуэля Эшлиманна (см. ниже).
Хорошая норма засева для Lactobacillus составляет 100-125 миллиардов клеток на 5 галлонов сусла, хотя нормы засева для Lactobacillus не так важны, как для дрожжей. Имея руководства производителя по подсчету клеток или выполняя подсчет клеток вручную сразу после роста клеток в стартере, а затем засевая точно такое же количество клеток в сусло – лучший подход для определения нормы внесения. Однако подсчет клеток Lactobacillus под микроскопом может быть затруднен из-за небольшого размера клеток, поэтому вместо подсчета клеток обычно говорят про объемы стартера, когда речь идет о нормах внесения Lactobacillus. Общая рекомендация – внесение ~ 0,5-1 литра на ~ 20 литров сусла (~ 0,75-1 галлона на баррель) стартера Lactobacillus (см. ниже). Обратите внимание, что точные рекомендованные объемы стартера коммерческих культур могут отличаться от производителя к производителю, и их рекомендации могут отличаться от наших. Достижение точных норм засева для Lactobacillus, как правило, не является необходимым, потому что чрезмерный засев не оказывает отрицательного воздействия, а недостаточный засев также менее проблематичен, чем недостаточный засев дрожжей (при недостаточном засеве есть риск, что лактобактерии произведут меньше кислоты, чем должны произвести определённые виды Lactobacillus) . По этим причинам, а также из-за сложности оценки количества клеток (тип стартовой среды, штамма и других переменных), калькулятор нормы засева для Lactobacillus в настоящее время не существует. Однако расчеты, основанные на объеме стартера и свежести, должны быть близкими к истине.
Степень роста, которая происходит в стартере, сильно варьируется в зависимости от типа среды стартера, и фактическое количестве клеток неизвестно, за исключением случаев, если пивовар все же может подсчитать клетки. Мэтт Миллер из Sour Beer Blog и Ричард Прейсс из Escarpment Yeast Labs советуют, что если возможно достигнуть идеального роста (1-2 миллиарда клеток / мл) (например, с помощью процедуры Самуэля Эшлиманна или среды MRS), то внесение всего 100 -125 мл свежего стартера Lactobacillus на 5 галлонов пива поможет достичь желаемой кислотности в течение 24 часов. По словам Мэтта, умеренно хороший рост в стартере дает около 500 миллионов клеток/мл, что дает 400 мл стартера на 5 галлонов, а низкий рост дает около 100 миллионов клеток/мл, в результате чего необходимо использовать 2 литра закваски на 5 галлонов. Если степень роста не может быть точно определена путем подсчета клеток под микроскопом, то внесение 0,5–1 литра свежего стартера Lactobacillus на 5 галлонов сусла гарантирует, что будет внесено адекватное количество клеток.
Еще одна вещь, которую следует учесть: рекомендуется как можно быстрее достичь pH 4, чтобы предотвратить неприятные запахи от возможной контаминации микробами. Большая норма внесения культуры позволит быстрее опустить уровень pH. Поэтому, если не используется процедура подготовки стартера Самуэля Эшлиманна, рекомендуется вносить 0,5-1 литр закваски на 5 галлонов сусла. Даже при использовании процедуры Самуэля Эшлиманна чрезмерный засев Lactobacillus не должен вызывать беспокойства, поэтому не лишним будет подумать о той же норме внесения 0,5–1 литра на 5 галлонов, если только пивовар не уверен точно, что в стартере достигнута высокая скорость роста культуры, в этом случае 100-125 мл на 5 галлонов сусла / пива должно быть достаточно (опять же, точные нормы засева для Lactobacillus, как правило, не так важны, как нормы засева дрожжей). Другими факторами, которые могут повлиять на эффективность стартера, рассчитанного по объему, являются вид/штамм используемой Lactobacillus, степень контаминации дрожжами и возраст стартера Lactobacillus. Для некоторых видов/штаммов может потребоваться больший объем закваски, а также он потребуется, если дрожжи загрязнили стартер или сусло. Если культура Lactobacillus старше 1 месяца, следует приготовить новый стартер. Хранение отдельной колбы Эрленмейера для стартера Lactobacillus может помочь предотвратить заражение дрожжами, а также использование стерилизационного оборудования, такого как автоклав или скороварка.
Стартовые среды, которые используют пивовары, включают стартеры с DME и стартеры из яблочного сока. Они подходят для многих пивоваров. Однако Самуэль Эшлиманн из Eureka Brewing Blog показал, что использование DME с небольшим количеством яблочного сока, мела и дрожжевых питательных веществ обеспечивает близкую к оптимальной плотность клеток, которая соответствует плотности клеток на среде MRS. Конкретные питательные вещества, которые увеличивают рост клеток, – это тиамин (витамин B1) или комбинация тиамина и рибофлавина (витамин B2). Например, было показано, что тиамин необходим для того, чтобы L. brevis эффективно превращали пируват в молочную кислоту и этанол. Добавление этих питательных веществ может способствовать росту клеток. Например, было обнаружено, что добавление витамина H (биотина) значительно увеличивает рост L. plantarum в лабораторных условиях.
Для окончательного вывода, потребуется больше экспериментов, но перемешивание считается важным фактором роста как для дрожжей, так и для бактерий в целом. Небольшое перемешивание на магнитной мешалке или орбитальном шейкере, или частое осторожное перемешивание вручную приводит к более быстрому росту и большему количества организмов. Перемешивание позволяет микробам находится во взвеси в растворе. Это также увеличивает доступ микробов к питательным веществам и равномерно распределяет отходы. В не перемешиваемом стартере микробы ограничены скоростью диффузии питательных веществ, что приводит к более медленному и более стрессовому росту. Если перемешивание невозможно по какой-либо причине, успешный стартер можно приготовить без перемешивания. Sam Aeschlimann сообщил о хороших успехах при использовании стартеров Lactobacillus, которые не перемешивались.
Хотя Lactobacillus толерантны к кислороду, кислород обычно не влияет отрицательно на их рост (за исключением L. plantarum, который, как было показано, вырабатывает небольшое количество уксусной кислоты в присутствии кислорода и отсутствии глюкозы), таким образом обычно кислород не нужен (исключением может быть L. brevis, который, как было показано, немного увеличивает скорость роста в присутствии кислорода). Поэтому, как правило, лучше не допускать контакта стартера Lactobacillus с кислородом, используя гидрозатворы и пр. Если происходит контакт с воздухом, но стартер не пахнет так, как будто он был контаминирован, то стартер можно использовать.
Неправильно высушенные Lactobacillus могут вызвать густой осадок в стартовых средах. См. this advice from Mark Riester.
Для получения информации о стартере для смешанных культур см. Mixed Culture Starters
Подготовка стартера по методу Самуэля Эшлиманна
Самуэль Эшлиманн из Eureka Brewing Blog (см. Samuel Aeschlimann from Eureka Brewing Blog) провел серию экспериментов, в ходе которых был найден рецепт стартера на основе DME, который дает очень высокую плотность клеток, аналогичную плотности среды MRS, что обеспечивает оптимальную скорость роста Lactobacillus. Рецепт этого стартера: 1.040 SG (10P) сусло DME с 10% яблочного сока + 1,5-2 грамма мела (CaCO3) на литр + питательные вещества для дрожжей (первоначально Эшлиман рекомендовал 20 граммов мела, но теперь мы рекомендуем гораздо меньшее количество мела; подробности см. ниже). Это стартер может быть столь же эффективным без добавления 10% яблочного сока, но, насколько нам известно, подтверждений этому нет. Что касается использования мела, то это наилучший буфер, потому что он не реагирует с CO2 по сравнению с чем-то вроде пищевой соды, поэтому он не будет распадаться при взаимодействии с воздухом или из-за производства CO2 лактобактериями. Он также имеет pKa (максимальная буферная емкость) около 4,6, что идеально для роста Lactobacillus. Тот факт, что он легко осаждается, также делает его идеальным для использования в качестве буфера. Джефф Мелло из Bootleg Biology, Ник Импеллиттери из The Yeast Bay и Брайан из блога Sui Generis предполагают, что использование меньшего количества CaCO3 в количестве 1,5-2 грамма на литр предпочтительнее, потому что такое количество легче выпадает в осадок и достаточно легко не допустить его попадания в пиво (хотя различия в росте от меньшего количества мела не проверялись). Чтобы создать 1-литровую закваску для 20 литров сусла, следуйте этим инструкциям:
- Добавьте 100 граммов DME примерно в 900 мл воды и пастеризуйте/кипятите, как обычно для стартера. Должно получиться сусло с плотностью 1,040 SG (10P).
- Охладите сусло DME до желаемой температуры инкубации (см. п. 4) и добавьте 100 мл пастеризованного яблочного сока, 1,5-2 грамма мела (CaCO3) и половину чайной ложки питательных веществ для дрожжей. Мел не растворяется в растворе, так что не беспокойтесь об этом. Кипячение яблочного сока может разрушить некоторые питательные вещества, находящиеся в нем, которые помогают Lactobacillus в их росте, и, поскольку он пастеризованный, в кипячении нет необходимости.
- Лучше всего не аэрировать стартер, хотя для L. brevis может быть исключение. Некоторые люди предпочитают перемешивать стартер закрывая сосуд воздушной пробкой (гидрозатвором), чтобы бактерии оставались во взвешенном состоянии, другие не используют перемешивание и держат стартер неподвижным. Перемешивание может улучшить скорость роста за счет равномерного распределения отходов и питательных веществ. Одно из преимуществ отказа от мешалки, по крайней мере, до тех пор, пока пивовар не ознакомится со своей культурой, состоит в том, что верхняя часть стартера начнет очищаться, когда стартер будет сброжен/готов.
- Стартер следует держать при температуре, наилучшим образом подходящей для выращивания культуры, как указано в таблице по характеристикам культур.
- Обратитесь к приведенным выше таблицам культур, чтобы узнать, как долго следует инкубировать стартер перед внесением (24–48 часов – общее правило). Если магнитная мешалка не используется, одним из признаков того, что стартер готов, будет то, что верхняя часть стартера начнет очищаться (мутность – показатель того, что культура растет, и как только верхняя часть стартера начинает очищаться, то это является признаком остановки роста).
- Мел нежелательно добавлять в пиво из-за его буферного эффекта. Мел осаждается в течение нескольких часов после добавления в стартер или, если используется мешалка, через пару часов после ее выключения. Lactobacillus должна оставаться во взвешенном состоянии в течение как минимум одного или двух дней после того, как стартер будет готов, поэтому перемешивание стартера не требуется, хотя это, безусловно, одна из опций. Если стартер взболтался, подождите пару часов, чтобы мел снова выпал. После того, как мел осядет на дно колбы, вылейте всю жидкость из верхней части стартера в сусло/пиво и оставьте осадок мела. Не делайте колдкраш для стартера, поскольку это может отрицательно сказаться на здоровье бактерий.
Визуальное сравнение роста Lactobacillus с CaCO3 и без CaCO3; фото предоставлено Джеффом Мелло из Bootleg Biology.
Модифицированные версии
Микробиолог доктор Мэтт Хамбард использует модифицированную версию вышеупомянутого рецепта: смешайте 10% яблочного сока (без консервантов) с суслом 1,010 SG и столовой ложкой карбоната кальция на каждый галлон. Делайте стартер в течение 2 дней при температуре ~ 90F (32С), а затем охладите до температуры холодильника и храните в холодном состоянии до готовности к использованию (засевать в холоде – это нормально). Чтобы поддерживать культуру в течение длительного времени, каждые ~ 4 недели перемешивайте культуру, возьмите 10-15% жидкой культуры и добавьте ее в новую партию стартера и выращивайте новый стартер в течение 2 дней, как было указано ранее. До тех пор, пока дрожжи не загрязнят процесс, молочнокислые бактерии при таком методе могут сохраняться неограниченно долго.
Ник Импеллиттери из The Yeast Bay поделился своим составом 1-литрового стартера: 25 г декстрозы, 10 г Fermaid O (подкормка для дрожжей), 2,5г CaCO3, 100 мл яблочного сока (без консервантов), 20 мл томатного сока (без консервантов), 1 мл Твин 80; QS с деионизированной водой до 1 л; pH ~ 6,2-6,3.
Смотрите также: Lacto Starters, by Bryan of Sui Generis blog для получения дополнительной информации о стартерах для Lactobacillus.
Информацию о средах для культивирования см. в разделе «Laboratory Techniques».
Рост клеток
«Обычно я выращиваю их в анаэробных условиях в среде MRS. Кажется, что она работает очень хорошо и дает хороший рост. Лично я добился наибольшего успеха в среде MRS (только для культивирования из замороженных запасов культур; MRS не подходит для культивирования из пищевых продуктов, и полученные побочные продукты следует декантировать или гранулировать; MRS не следует использовать для крупномасштабного размножения) и в анаэробной среде, хотя я знаю, что некоторые штаммы Lactobacillus отлично растут в аэробных условиях. Проблема роста лактобактерий состоит в производстве ими молочной кислоты, которая начинает угнетать их собственный рост. MRS содержит буфер, который помогает бороться с падением pH из-за метаболизма LAB, буфер поддерживает pH около 6-6,5 (я так думаю) для их оптимального роста. Я обычно культивирую их при 35 C, но иногда в инкубаторе нет места (как сейчас), и я просто использую магнитную мешалку с воздушным затвором», – Ник Импеллиттери из The Yeast Bay об общем росте клеток Lactobacillus.
Максимальная плотность клеток Pediococcus и Lactobacillus составляет около 1-9 миллиардов клеток/мл, в зависимости от доступных питательных веществ (аминокислот и пр.) в питательной среде. Темпы роста клеток совпадают с падением pH и повышением титруемой кислотности. Было доказано, что пивное сусло является нормальной питательной средой для выращивания Lactobacillus. Как рост, так и снижение pH начинают стабилизироваться примерно через 12-48 часов (при условии, что совместно с Lactobacillus нет дрожжей, с которыми нужно было бы конкурировать). Титруемая кислотность также резко возрастет во время роста, но также будет продолжать расти после завершения роста. Максимальный рост, на который способен конкретный вид или штамм, можно объяснить его толерантностью к pH и, следовательно, его способностью производить больше кислоты. Например, было показано, что L. plantarum растет в среде с очень низким pH (3,37–3,0 pH, в зависимости от штамма) из-за их способности лучше контролировать большие градиенты pH между цитоплазмой и внешней средой. Магистерская диссертация Томаса Хюббе показала, что у штамма L. brevis наблюдался всплеск роста через 50 часов, а затем небольшой спад в количестве клеток через 96 часов, после чего количество клеток оставалось неизменным в течение как минимум 528 часов.
[/hide]
Обсудим?
Автор публикации
Другие записи этого автора:
Балтийский портер. Пивоваренные традиции ...
