Зачем считать дрожжевые клетки?

Подсчет клеток – это метод определения концентрации клеток в жидкости. Представьте, что вы хотите приготовить партию пива объемом 5 галлонов (18,9 л) с исходной плотностью 1,048 (12 °). Сколько дрожжей нужно для здорового брожения? Это можно рассчитать с помощью различных калькуляторов дрожжей, например, от Дж. Зайнашева ( mrmalty.com). Для этого примера правильным количеством дрожжей должно быть 170E9 клеток. Предположим, у вас нет нужного количества дрожжей, и вам нужно размножить дрожжи с помощью стартера (ов). Вы даже можете собрать дрожжи из предыдущей партии, чтобы сбродить другую партию. Теперь возникает вопрос: как можно быть уверенным, что у вас будет точное количество дрожжевых клеток после стадии (этапов) размножения или сколько дрожжевого осадка вам нужно собрать, чтобы получить нужное количество дрожжевых клеток? На этот вопрос точно можно ответить подсчетом клеток.

Что мне нужно для подсчета дрожжевых клеток?

Прежде всего, вам понадобится счетная камера. Счетная камера, улучшенная по Нойбауэру(имп. аналог камеры Горяева. прим.MrD`Anger), очень хорошо работает с дрожжевыми клетками. Подробнее о счетной камере позже. Во-вторых, вам нужен микроскоп с увеличением более 400x. В-третьих, оборудование для разбавления образцов дрожжей. Пипетки и градуированные цилиндры подойдут.

Что такое счетная камера?

Счетная камера представляет собой специальное предметное стекло (размером с обычное предметное стекло микроскопа) с выгравированными квадратами и покровным стеклом (не показано). Квадраты расположены в центре камеры (обозначены кружком на рис. 1).

Теперь о квадратах счетного устройства. Есть девять больших [hide]квадратов (красных). В красном квадрате снова 16 квадратов (зеленые). Есть еще квадраты поменьше (желтый и синий). Счетную камеру можно использовать для ячеек разного размера. Если у вас есть более крупные клетки, такие как лейкоциты, вы можете пересчитать их в красных и зеленых квадратах. В случае дрожжевых клеток вы можете использовать желтые квадраты, потому что эти клетки меньше лейкоцитов.

Когда вы готовите камеру, вы закрываете квадраты покровным стеклом. Зазор между квадратами и покровным стеклом составляет ровно 0,1 мм. Площадь красного квадрата равна 1 мм ² , желтого квадрата равна 0,040 мм ² и, следовательно, равна 4 нл (= 4 нанолитра) объема с покровным стеклом, установленным на счетной камере. Таким образом, квадраты представляют собой очень маленький объем. Подсчет клеток в этих квадратах может дать вам в конечном итоге информацию о концентрации клеток.

Как подготовить и использовать счетную камеру?

Пожалуйста , обратитесь к видео . Обратите внимание: частицы, показанные на видео, примерно в 100 раз больше, чем клетки дрожжей. Для этих частиц наиболее полезными являются красные квадраты. С другой стороны, для дрожжевых клеток используйте желтые квадраты.

Еще две вещи. Сначала о покровном стекле. На видео покровное стекло просто накладывается на счетную камеру (синоним гематоцитометра). Я сначала дышу на покровное стекло, а затем кладу его на счетную камеру. Если вы все сделаете правильно, вы должны увидеть кольца Ньютона . Если эти кольца можно увидеть, зазор между счетной камерой и покровным стеклом плотный.

Во-вторых, о правилах подсчета. Как уже упоминалось, есть несколько приемлемых способов сделать это. Я научился считать клетки, соприкасающиеся с тройной линией сверху и с правой стороны. Клетки, соприкасающиеся с линиями внизу и слева, не учитываются. Подробнее об этом позже. Пока о принципах.

Приведем пример

Вы сделали стартер (1000 мл) и хотите знать, сколько у вас дрожжевых клеток, и проверить, достаточно ли у вас дрожжевых клеток для ферментации вашей партии.

1. Сначала разбавьте 1 мл стартера 99 мл воды или изотонического раствора хлорида натрия (9 г хлорида натрия, растворенных в 1 л воды). Это этап разбавления 1: 100. Если вы ожидаете низкой концентрации дрожжей, можно использовать разбавление 1:10 или даже загрузить камеру неразбавленным стартером. (Если дрожжи стали оседать, то надо их разболтать, как минимум. прим.MrD`Anger)

2. Затем вы капаете в камеру, и она выглядит как на следующей картинке(Когда притрете стекло, капают сверху камеры в зазор между стеклом и камерой, жидкость сама распределеится.прим.MrD`Anger):

Здесь вы можете увидеть в основном дрожжевые клетки. Не беспокойтесь о синем цвете. Вот так может выглядеть ваш образец дрожжей в счетной камере. Теперь обратите внимание на тройные линии слева, сверху и справа от изображения. Нижний на картинке не виден. Но есть и такие строки внизу. Если вы сравните это с линиями на рис. 2, вы увидите, что вы смотрите на желтый квадрат с синими квадратами 4 x 4. Тройные линии – это линии границы желтых квадратов. Следующее, что нужно сделать, это подсчитать все ячейки в желтом квадрате (между тройными линиями). Пожалуйста, посмотрите  видео уже упоминалось выше, как вы считаете клетки. Как упоминалось выше, существует несколько правил подсчета клеток. Моя техника состоит в том, чтобы считать только клетки, соприкасающиеся с линиями сверху и с правой стороны. Давайте посмотрим на картинку выше. Во втором квадрате в левом верхнем углу есть клетка, касающаяся тройной линии (отмеченной цифрой 1). Эта клетка включена в подсчет. Клетки, помеченные как 2 и 3, также включены. Две клетки в непосредственной близости от 4 также включены. клетка под цифрой 4 все еще находится в квадрате. Клетки выше 4 не включаются, поскольку они не находятся в квадрате. Следующая темно-синяя клетка 5. Если вы посмотрите на клетку, то она прямо у границы. Думаю, здесь вы можете решить, включаете ли вы клетку или нет. И, наконец, клетка номер 6 не включена, так как она касается строк с левой стороны.

Допустим, вы насчитали 65 клеток. Затем вы считаете еще четыре таких квадрата. Всего пять желтых квадратов. Допустим, вы насчитали 60, 70, 62 и 55 в следующих желтых квадратах.

3. Сложите все числа вместе: 65 + 60 + 70 + 62 + 55 = 312 клеток. Таким образом, у вас есть 312 клеток в 20 нл (поскольку один желтый квадрат равен 4 нЛ, а всего вы насчитали пять).

4. Умножьте 312 на 5, чтобы получить концентрацию в 100 нл. В этом случае у вас 1560 клеток в 100 нл. Или 15600 клеток в 1 мкл.

5. Затем умножьте 1560 клеток на 10000, чтобы получить концентрацию на мл (преобразование из 100 нл в мл). В данном случае клетки 1.56E7 в 1 мл.

6. Последнее, что нужно сделать, это включить разведение 1: 100 с самого начала. Умножьте 1,56E7 клеток на мл на 100, чтобы получить конечную концентрацию дрожжей 1,56E9 клеток на мл. Это концентрация дрожжей в вашем стартере на 1000 мл. В общей сложности теперь у вас есть 1,56E12 дрожжевых клеток в дрожжевом стартере (1,56E9 клеток на мл x 1000 мл = 1,56E12).

Возвращаясь к партии пива объемом 5 галлонов (18,9 л) с исходной плотностью 1,048 (12 °). Ранее мы подсчитали, что для этой партии вам потребуются дрожжевые клетки 170E9. В вашем стартере концентрация клеток составляет 1,56E9 клеток на мл. Клетки 170E9, разделенные на 1,56E9 клеток на мл, дают объем примерно 109 мл. Поэтому вам необходимо внести 109 мл осадка, чтобы получить нужное количество дрожжевых клеток. Фактически, в вашем дрожжевом стартере будет достаточно дрожжевых клеток для ферментации примерно 170 л (45 галлонов) 1,048 (12 ° P) сусла.

Подводя итог, лучший способ получить представление о концентрации дрожжей в стартере или дрожжевой суспензии – это использовать счетную камеру и подсчитать пять желтых квадратов. Сложите все числа и умножьте на 50000, чтобы получить концентрацию в клетках на мл. И не забывайте фактор разбавления.  Все просто…

На мой взгляд, если считать дрожжи из стартера свежей дрожжевой взвеси, можно не беспокоиться о здоровье дрожжей. Просто посчитайте дрожжевые клетки и получите представление о концентрации дрожжей. С другой стороны, если вы считаете дрожжи, которые больше не являются самыми здоровыми, представляется целесообразным также определить жизнеспособность дрожжей. Это означает, что вы должны знать, сколько дрожжевых клеток погибло. Подробнее о тесте на жизнеспособность в будущем посте. Следите за новостями.

[/hide]