Бреттаномицеты. Часть 2.
Брожение, стартеры, хранение
Первичная и вторичная ферментация
Brettanomyces можно добавлять в пиво на разных этапах брожения. При использовании в качестве первичной культуры производимое пиво часто воспринимается как фруктовое и не очень “фанковое”. Для первичной ферментации потребуется большая норма засева (что-то среднее между нормой засева для эля и лагера). См. 100% Brettanomyces Fermentation для получения дополнительной информации о нормах внесения, а также о характеристиках 100% ферментации Brettanomyces.
Если их добавить в пиво, которое уже было сброжено с помощью Saccharomyces, или смешать Brettanomyces с Saccharomyces (совместное внесение), можно получить более широкий диапазон вкусов, включая более необычные ароматы, путем замены некоторых ароматических соединений, образующихся во время ферментации Saccharomyces, на другие ароматические соединения, хотя Brettanomyces также может производить фанковые фенолы самостоятельно (de novo) без фенольных предшественников, производимых из Saccharomyces. Небольшого количества клеток Brettanomyces достаточно для создания этих вкусов, если они вносятся после и вместе с Saccharomyces. Обычно при внесении Brettanomyces стартер не [hide]требуется, если только Brettanomyces не используется в качестве 100% культуры для брожения. См. Mixed Fermentation, Brettanomyces and Saccharomyces Co-fermentation, and Brettanomyces secondary fermentation experiment для получения дополнительной информации об использовании Brettanomyces во вторичной ферментации.
Стартер
При внесении на брожение только Brettanomyces из коммерческой чистой или смешанной культуры при отсутствии других микробов рекомендуется сделать стартер. Если Brettanomyces вводится на вторичное брожение, стартер не требуется, за исключением случаев, когда Brettanomyces сильно потерял жизнеспособность из-за возраста, воздействия тепла и т. д., или пивовар предпочитает более высокую норму внесения (текущая информация свидетельствует об отсутствии значительной разницы во вкусе между высокими и низкими нормами засева при вторичной ферментации Brettanomyces; см. Brettanomyces secondary fermentation experiment). Сусло для стартера, приготовленное из сухого солодового экстракта с начальной плотностью около 1,040, подходит для большинства штаммов B. bruxellensis. Для штаммов Brettanomyces, таких как многие штаммы B. anomalus, которые не ферментируют мальтозу, подойдет смесь 50% DME и 50% столового сахара или декстрозы при начальной плотности 1,040. Если не наблюдается достаточного роста, можно добавить питательные вещества для дрожжей в рекомендованной производителем норме. Как и в случае с другими видами дрожжей, температура напрямую влияет на скорость роста Brettanomyces. Оптимальный диапазон температур для скорости роста Brettanomyces составляет 25–32 ° C (77–90 ° F). Рост примерно вдвое медленнее при 20 ° C (68 ° F). Brettanomyces по-прежнему будут расти, но намного медленнее при температурах ниже 15 C (59 ° F), однако одно исследование показало немного более высокую жизнеспособность в течение всего периода ферментации при 15C, поскольку в отличие от оптимального диапазона температур роста 20-32 ° C при температуре 35 C (95 ° F) рост и жизнеспособность с течением времени значительно подавляются. Для получения информации о стартерах для смешанных культур см. Mixed Culture Starters.
Два подхода к стартерам
Обычно существует два подхода к приготовлению стартера для Brettanomyces. Первый – использовать магнитную мешалку, установленную на средне-высокие обороты, с фольгой наверху колбы на 7-8 дней, далее сделать колдкраш, а затем декантировать пиво перед внесением осевших дрожжей. Второй подход – использовать орбитальный шейкер, установленный на 80 об / мин для создания полуаэробной среды (это означает, что уровни кислорода низкие, но не отсутствуют вовсе) в течение 7-8 дней, колдкраш можно пропустить, и весь стартер залить в сусло. Альтернативой второму подходу является использование мешалки на очень низком уровне, так что образуется только очень маленькая «ямка» вихря. Если мешалка отсутствует, дайте стартеру начальную дозу чистого кислорода, а затем накройте его фольгой, чтобы кислород мог медленно диффундировать в стартер, и осторожно перемешивайте как можно чаще. Уровень кислорода – важный фактор, который следует учитывать при принятии решения, какой из двух вышеупомянутых методов использовать для стартера Brettanomyces. Brettanomyces создает уксусную кислоту в присутствии кислорода, потенциально приводя к более высокому уровню этилацетата, который в больших количествах считается неприятным запахом. По мере увеличения количества кислорода увеличивается рост клеток, но увеличивается и производство уксусной кислоты. Количество продуцируемой уксусной кислоты зависит от вида / штамма, поэтому для некоторых штаммов может быть полезна большая аэрация без отрицательного эффекта образования слишком большого количества уксусной кислоты. Другим штаммам может потребоваться менее аэробный стартер (полуаэробный), чтобы производить максимальное количество клеток с минимальным содержанием уксусной кислоты. Помимо продукции уксусной кислоты, было замечено, что некоторые штаммы Brettanomyces, выращенные в аэробных условиях, продолжают вырабатывать THP при переводе в анаэробные условия. См. подробности в THP .
Это представляет собой своего рода дилемму при выращивании Brettanomyces в стартере. Пивовар должен взвесить все за и против того, какую аэрацию нужно обеспечить. Если Brettanomyces будет использоваться, например, для ферментации 100% Brettanomyces, то лучшим выбором будет мешалка с фольгой, закрывающей колбу. Если вместо этого Brettanomyces вводится во вторичную среду с целью длительного выдерживания, то высокое количество клеток не так необходимо, и риск добавления большего количества уксусной кислоты / этилацетата в выдерживаемое пиво возрастает. Если во время роста клеток в стартере вырабатывается много уксусной кислоты, можно сделать колдкраш и перелить в сусло только осевшие дрожжи. Бреттаномицеты может потребоваться очень долгое время, чтобы флокулировать. Пивовару может потребоваться несколько дней для полного осаждения клеток.
Кроме того, Brettanomyces, подвергшийся колдкрашу, может медленнее начать ферментацию. Если пивовар считает, что количество произведенной уксусной кислоты было незначительным, то колдкраш можно пропустить, и можно вылить стартер целиком. Даже если в закваске содержится много уксусной кислоты, количество уксусной кислоты в объеме стартера довольно незначительно. Если стартер не будет использоваться в течение месяца, то аэробный стартер – не лучший вариант, поскольку присутствие большого количества уксусной кислоты со временем медленно убивает Brettanomyces. В этом случае стартер следует слегка встряхнуть (или иногда вручную перемешать) и установить на колбу воздушный затвор, чтобы не допустить проникновения кислорода. Хотя, необходимы дополнительные эксперименты, считается, что перемешивание является важным фактором для любых видов микробов (дрожжей и бактерий). Мягкое перемешивание на мешалке или орбитальном шейкере или частое осторожное перемешивание вручную приводит к более быстрому росту и большему количеству организмов. Перемешивание удерживает микробы в среде. Это также увеличивает доступ микробов к питательным веществам и равномерно распределяет отходы. В не перемешиваемой закваске микробы ограничены скоростью диффузии питательных веществ, что приводит к более медленному и более стрессовому росту.
Поддержание температуры 77–86 ° F / 25–30 ° C приводит к более быстрому росту, чем более низкие температуры, и для достижения максимального роста клеток Brettanomyces рекомендуется обычно около 7-8 дней, однако некоторые штаммы могут расти быстрее за 3-4 дня. Когда стартер приобретает насыщенный кремовый цвет, перелив следует делать в течение нескольких часов после появления этого визуального индикатора. Каждый этап стартере для Brettanomyces должен составлять 7-8 дней (или 3-4 дня для более быстрорастущих сортов). Для получения дополнительной информации о влиянии аэрации на рост Brettanomyces см. Mark Trent’s Brettanomyces Propagation Experiment.
Калькуляторы нормы внесения
Существующие калькуляторы нормы внесения для дрожжей не подходят для определения норм засева Brettanomyces на основе размера стартера, поскольку максимальная плотность клеток Brettanomyces на мл сусла в 3-6 раз превышает плотность клеток Saccharomyces. Например, определённый штамм Saccharomyces может достигать плотности 130 миллионов клеток на мл в сусле 1.040 (разные штаммы Saccharomyces также могут иметь разную плотность клеток, хотя в целом они намного ниже, чем у Brettanomyces). Сообщается, что различные уровни плотности клеток штамма Brettanomyces составляют от 600 до 885 миллионов клеток на мл в 1,040 сусла в зависимости от вида / штамма. Поскольку калькуляторы дрожжей основаны на плотности клеток S. cerevisiae или S. pastorianus, использование одного из этих инструментов для стартеров Brettanomyces в действительности приведет к неожиданно высокому количеству клеток. В настоящее время недостаточно данных для точного определения объемов стартера для Brettanomyces, особенно потому, что каждый штамм и вид имеют разную максимальную плотность клеток на мл сусла. Однако внесение около 500-600 мл стартера Brettanomyces на 5 галлонов сусла 1.060 SG позволит достичь нормы внесения, аналогичной норме внесения лагерных дрожжей, рекомендованной для 100% ферментации Brettanomyces. Omega Yeast Labs в настоящее время работает над проектом по созданию более точного калькулятора нормы засева Brettanomyces (он также будет содержать расчеты нормы засева для определенных штаммов Saccharomyces, чего нет в существующих калькуляторах засева дрожжей). Учитывая эту информацию, многие пивовары исторически использовали уровень засева для лагеров в онлайн-калькуляторах при подготовке стартера Brettanomyces (например, около 2000 мл на 5 галлонов). Фактически это означает, что они использовали в 4-5 раз больше клеток Brettanomyces, чем необходимо. Однако, если такая очень высокая норма внесения дает хорошие результаты, ее следует использовать и дальше. Изучение норм внесения Brettanomyces для 100% ферментации Brett — это то, что нужно, если мы знаем, каковы на самом деле наши нормы внесения; многие пивовары в 4-5 раз увеличивают норму внесения (как для лагеров), вместо подсчета клеток под микроскопом.
Среда для роста MYPG и другие среды
Среда MYPG («Солод, дрожжи, пептон, глюкоза») для выращивания является более лучшей, чем сусло, для первоначального выращивания Brettanomyces на чашках или уклонах. При выращивании в сусле Brettanomyces часто проходят через 24-часовую фазу задержки, фазу роста, другую фазу задержки и вторую фазу роста (все в течение 7-8 дней). При выращивании на субстрате MYPG существует только одна фаза роста и отсутствует лаг-фаза, что, как сообщил Якобсон, приводит к увеличению количества клеток за то же время. Клетки, выращенные в MYPG, также лучше приспособлены для роста в сусле. Практические инструкции по приготовлению этого субстрата можно найти в блоге Джейсона Родригеса “Brew Science – Homebrew Blog“. К сожалению, выращивание Brettanomyces в MYPG для пивоваров не очень практично из-за необходимости почти в 4 раза большего количества MYPG по сравнению с суслом для получения той же нормы внесения. На пивоваренном заводе или в домашнем пивоварне более практично использовать сусло для стартера Brettanomyces. Для других предлагаемых субстратов для выращивания Brettanomyces и, возможно, других дрожжей, см. Laboratory Techniques.
Подсчет клеток
Использование метиленового синего, хотя и популярно на пивоваренных заводах, но оказалось неточным при подсчете клеток Brettanomyces. Было показано, что окрашивание трипановым синим дает более точные результаты подсчета клеток, чем метиленовый синий. Одна из проблем с подсчетом клеток Brettanomyces заключается в том, что они имеют тенденцию образовывать псевдогифы (удлиненные клетки, которые прикрепляются друг к другу) во время роста. Это затрудняет подсчет клеток. Мартыняк и др. (2017) предложили новый способ подсчета клеток Brettanomyces с использованием флуоресцентной способности цитометра изображений Nexcelom X2 с пятнами, созданными из акридинового оранжевого (AO) и йодида пропидия (PI). AO-PI окрашивает только ядра отдельных клеток, что позволяет легко подсчитывать их с помощью цитометра независимо от образования псевдогиф. В ходе своего исследования они обнаружили, что штамм B. anomalus “clausenii” формирует больше псевдогиф, чем два штамма B. bruxellensis (один из которых упоминается как штамм “lambicus”), и это соответствует более высокой жизнеспособности с течением времени. Поэтому было высказано предположение, что псевдогифы могут играть роль в более длительном выживании одних штаммов Brettanomyces по сравнению с другими. Было замечено, что псевдогифы могут быть менее распространены в культурах Brettanomyces, выращенных в сусле, по сравнению с лабораторными средами, что упрощает их подсчет, но этот метод упрощает подсчет клеток, которые прикреплены через псевдогифы. Этот метод критиковали за относительно высокую стоимость (как для флуоресцентного микроскопа, так и для красителей). Смотрите также: MBAA Podcast interview with Leo Chan on automating cell counting with of Brettanomyces psuedohyphae. об автоматизации подсчета клеток с помощью Brettanomyces psuedohyphae.
Хранение
Крупные дрожжевые лаборатории часто хранят дрожжи в лабораторном морозильнике с температурой -80 ° C в растворе среды / глицерина, хотя этот вариант обычно непрактичен для пивоваров. Следующий лучший вариант для длительного хранения Brettanomyces – замораживание с 10% глицерином в домашней морозильной камере. Однако влияние хранения на дрожжи при такой высокой и часто изменяющейся температуре не оценивалось с научной точки зрения. Традиционно дрожжи Saccharomyces хранятся на наклонных поверхностях в холодильнике и могут обеспечивать хранение от нескольких месяцев до 2+ лет, в зависимости от типа используемой среды (использование минерального масла на наклонных поверхностях продлевает срок хранимых Saccharomyces). Однако домашние пивовары сообщают о плохой выживаемости Brettanomyces на уклонах. Данные MTF показали многообещающие результаты за счет буферизации наклонной среды. Согласно этим данным, Brettanomyces хорошо хранилась до 100 дней на буферной среде. Неизвестно, как долго жизнеспособность будет оставаться высокой на забуференных наклонах. Чашки с агаром являются наименее эффективным решением, и, как неофициально наблюдали, они снижают жизнеспособность Brettanomyces в течение нескольких месяцев. Возможно, лучший способ длительного хранения Brettanomyces – это стерилизованное (автоклавное или сваренное под давлением) сусло или MYPG. Хотя это не так идеально, как замораживание с глицерином при -80 ° C, это наиболее практичный способ хранения Brettanomyces для пивоваров без лабораторного морозильника. Что касается температуры, было показано, что хранение в холодильнике в течение месяца лучше, чем при комнатной температуре. Однако через месяц Brettanomyces становится более жизнеспособным при хранении при комнатной температуре. Прежде чем предположить, что это относится ко всем штаммам Brettanomyces, необходимы дополнительные исследования. Чад Якобсон отметил, что после хранения Brettanomyces в холоде (мы не знаем, как Чад хранил культуры Brettanomyces, когда он наблюдал это, например, на чашках с агаром, на уклонах или в чем-то еще), через 6 месяцев Brettanomyces погибнет. Если Brettanomyces хранится в холоде, ферментация начинается очень медленно. Настоятельно рекомендуется приготовление закваски, если культура Brettanomyces хранилась в холоде. Чтобы изучить наблюдения Якобсона более контролируемым образом, Марк Трент провел эксперимент по хранению одного штамма Brettanomyces в сусле, MYPG, забуференном сусле (забуференном для предотвращения падения pH) и забуференном MYPG, и сравнил хранение Brettanomyces в каждом из растворов для хранения при комнатной температуре по сравнению с холодными температурами в течение 100 дней. Этот штамм Brettanomyces лучше всего выжил в незабуференном MYPG при комнатной температуре, и затем лучшим в незабуференном сусле при комнатной температуре, и меньше выжил в условиях холодного хранения для всех сред. Подробнее см. Brettanomyces Storage Survival Experiment. Следовательно, при хранении Brettanomyces в течение одного месяца или менее в сусле (или, возможно, в пиве) его следует хранить в холодильнике. Однако, если Brettanomyces будет храниться более одного месяца в сусле (или, возможно, в пиве), его следует хранить при комнатной температуре (до тех пор, пока больше данных не улучшит наше понимание). Обратите внимание, что в лучшем случае эти методы хранения значительно снизят жизнеспособность (80% +) в течение 3 месяцев, и следует использовать стартер, чтобы попытаться оживить культуру перед использованием. Было доказано, что периодическое кормление поддерживает жизнь Brettanomyces в пиве для пивоваров, у которых нет лаборатории; однако многие переменные могут иметь значение, насколько это будет эффективно для отдельных штаммов и в различных средах. Хотя не было проведено исследований, чтобы указать, какие существуют наилучшие методы кормления Brettanomyces, чтобы сохранить их живыми в пиве, мы рекомендуем попробовать этот метод: каждые 3-6 месяцев перемешивать сосуд, чтобы взболтать все дрожжи, а затем декантировать 70%-90% жидкости и замените ее на 1.040 сусло с питательными веществами для дрожжей. Этот метод удалит много старых дрожжевых клеток, сохранив при этом достаточно живых клеток для репликации. Некоторые сорта могут выдерживать длительные периоды выдержки в пиве; однако их жизнеспособность со временем значительно снизится. Интересно, что Brettanomyces остается более жизнеспособным с течением времени, если он был коферментирован с S. cerevisiae, чем если бы он был ферментирован без присутствия S. cerevisiae. Другой метод хранения Brettanomyces, как сообщается, сработал у Джастина Амарала. Этот метод предполагает хранение культуры в изотоническом растворе хлорида натрия. По сообщениям Amaral, культуры Brettanomyces выживают, по крайней мере, в течение 6-7 месяцев. Сюда входят и другие микробы (RVA Orchard Brett, ECY Dirty Dozen, Bright Yeast Labs Brett Chateaux, T. delbrueckii, L. plantarum, выделенный из Goodbelly, смесь Omega Lacto, Pediococus damnosus, Bootleg Biology Sour Weapon, Funk Weapon 2 и 3, и Brettanomyces изолированные у Yeast Bay). См. подробнее this Eureka Brewing blog article, перевод которой есть на сайте.
[/hide]
Пастеризация
Бреттаномицеты погибают при термической обработке 50С в течении 5 минут.
Обсудим?
Автор публикации
Другие записи этого автора:
Балтийский портер. Пивоваренные традиции ...
