Лактобактерии в пиве. Часть 4. Толератность к хмелю, алкоголю и пр.

Время на прочтение: 9 минут(ы)

Лактобактерии в пиве. Часть 4.

Толератность к хмелю, алкоголю и пр.

 

 

ЧАСТЬ 3

Влияние кислорода

Все прокариоты, включая все бактерии, классифицируются в зависимости от уровня кислорода, при котором они могут расти, и того, как они используют кислород, если вообще используют. Виды Lactobacillus обычно считаются «факультативными анаэробами» (или «факультативными аэробами»), однако они представляют особый случай. Факультативные анаэробы обычно получают энергию из кислорода, если он присутствует, через путь окислительного фосфорилирования, но в остальном участвуют в анаэробной ферментации. Виды Lactobacillus могут использовать кислород, но не путем окислительного фосфорилирования. Вместо этого они используют альтернативный путь. В таком случае используются флавинсодержащие оксидазы и пероксидазы для окисления NADH2 с помощью O2. Таким образом, лактобактерии уникальны тем, что стирают грань между факультативными анаэробами и другим классом прокариот, известным как «аэротолерантные анаэробы». Аэротолерантные анаэробы не используют кислород для выработки энергии, но могут расти в присутствии кислорода.

 

Важный вывод заключается в том, что кислород не оказывает значительного влияния на большинство видов Lactobacillus. Им безразлично, присутствует ли кислород для их собственного роста и производства энергии и молочной кислоты для пивоваров. Они также не производят значительного количества масляной кислоты или изовалериановой кислоты в присутствии кислорода.

Хотя, скорее всего, это не имеет отношения к пивоварению, в научной литературе можно найти несколько исключений. Например, L. plantarum, который является факультативно гетероферментативным видом, в отсутствии кислорода становится гомолактическим (Примечание переводчика: т.е. в таком варианте ферментации одна молекула глюкозы превращается в две молекулы молочной кислоты, т.е. штамм продуцирует только молочную кислоту без кислорода и этанола) и продуцирует только молочную кислоту. Однако после того, как источники питания исчерпаны, в присутствии кислорода L. plantarum переключается на гетеролактическую ферментацию и далее превращает молочную кислоту в уксусную кислоту. В лабораторных условиях преобразование молочной кислоты в уксусную кислоту происходило только в отсутствии глюкозы (это может не работать в пивном сусле, где другие ограничивающие факторы, такие как низкий pH, могут помешать L. plantarum продолжить свои метаболические процессы до того, как вся глюкоза будет ферментирована, т.е. сходные условия имеют при закислении в котле), и только во время стационарной фазы (после прекращения роста). Во время преобразования молочной кислоты в уксусную кислоту L. plantarum также продуцирует перекись водорода (H2O2), которая токсична для микроорганизмов и считается механизмом защиты L. plantarum. Тот же самый процесс наблюдался также у одного штамма L. brevis и в аналогичных условиях обеднения питательных веществ и кислорода. Важно понимать, что эти результаты были получены в лабораторных условиях и без какой-либо цели для пивоварения, поэтому не следует считать, что эти процессы важны для пивоварения. Omega Yeast Labs сообщает, что заметного образования уксусной кислоты не происходит, если кислород присутствует при засеве их смеси OYL-605 Lactobacillus, содержащей L. plantarum; пивовару не стоит аэрировать сусло во время закисления, но и специально избавляться от O2 не требуется. Таким образом, образование уксусной кислоты и перекиси водорода в типичных условиях пивоварения, когда присутствует мало кислорода или он отсутствует, вероятно, не должно вызывать беспокойства. Даже если Lactobacillus не погибнет при повторном кипячении, рекомендуется проводить аэрирование для работы дрожжей, особенно если пивовар полагается на один штамм пивных дрожжей для завершения ферментации. См. «Aeration for Mixed Fermentation». В некоторых случаях кислород может принести пользу некоторым видам. Например, было доказано, что один штамм L. brevis увеличивает скорость роста в присутствии кислорода. Магистерская диссертация Томаса Хюббе показала, что в лабораторных питательных средах «VLB-S7-S», «NBB®-A» и MYPG + циклогексмид оба протестированных штамма Lactobacillus (L. brevis и L. parabrevis) не показали роста в аэробной камере, но выросли в анаэробной камере, хотя это может быть эффектом той среды для культивирования, и не характерно для условий пивоварения. Смотрите также: Kettle souring.

 

 

Толерантность к хмелю

Ниже приведены комментарии Брайана из блога Sui Generis Brewing (см. Sui Generis Brewing blog):

Существует немало исследований о толерантности к хмелю; это непростая тема, так как на устойчивость к хмелю влияет ряд факторов. Чтобы еще больше усложнить ситуацию, толерантность к хмелю является индуцируемым признаком многих видов Lactobacillus, а это означает, что кажущийся восприимчивым к хмелю штамм может стать устойчивым при культивировании во все возрастающих дозах, а кажущийся устойчивым штамм может стать восприимчивым через одно или четыре поколения в период выращивания в безхмелевых средах.

Я уже несколько месяцев пытаюсь создать лакто-штамм с постоянной устойчивостью к высоким альфа-кислотам. Я культивировал L. brevis в увеличивающемся количестве сусла IBU (начиная с 10, в настоящее время с 25). Каждое 4-е поколение (1 поколение = субкультура лакто-культуры в стационарной фазе, а не количество делений клеток) я прохожу через 2 поколения среды без IBU, чтобы попытаться отобрать штаммы, которые поддерживают эту устойчивость. Похоже, что это сработало до ~ 18 IBU (обновлено: 20-30 IBU), но после этой точки сопротивление остается индуцируемым. Я надеюсь, что еще несколько поколений дадут мне стабильно устойчивый сорт. Обновление: я сделал крепкое (~ 80 IBU) сусло, которое я разбавил неохмеленным суслом. Я выращивал Lactobacillus в течение нескольких пассажей (1 пассаж = выращивание культуры до завершения, затем разбавлял ~ 1: 100 в свежем сусле для начала следующего пассажа) на заданном уровне IBU, затем переходил к суслу на 3 или около того IBU выше. Я тренировался 50-60 поколений, прежде чем достиг высокого уровня IBU (~ 3 месяца, 1-2 дня на поколение). Я никогда ничего не делал, чтобы определить, какая часть этого сопротивления передалась по наследству. Есть и другие варианты;

Я очистил (но не сохранил – ох) некоторые довольно устойчивые штаммы из зерна, сделав чашки, на которых вы наполовину наполняете тарелку под углом суслом с высоким IBU, а затем накладываете на это сусло без IBU. Это дает вам градиентную пластину с низким IBU на конце, где слой охмеленного сусла самый тонкий, и с высоким IBU там, где он самый толстый. Некоторые из этих штаммов были устойчивы к более чем 30IBU, но, когда я только начинал заниматься выращиванием дрожжей, я не стал их хранить.

Хмель содержит множество соединений, которые обладают бактериостатическим действием. Альфа-кислоты являются наиболее изученными, но было обнаружено, что другие соединения, такие как бета-кислоты, ряд полифенолов (например, ксантогумол) и даже некоторые ароматические масла (например, гумулен), оказывают некоторое ингибирующее действие на лактобациллы. Более поздние соединения (особенно бета-кислоты) являются причиной того, что выдержанный хмель сохраняет ингибирующие свойства несмотря на то, что он почти лишен альфа-кислот. Во всех случаях эти соединения, по-видимому, одинаково подавляют бактерии – все эти соединения содержат довольно большие плоские гидрофобные области. Этим областям не «нравится» находиться в воде, и поэтому они будут попадать в гидрофобное ядро бактериальной плазматической мембраны. Это открывает крохотные отверстия в мембране, которые не позволяют бактериям поддерживать ионный (в частности, протонный) градиент, что приводит к подавлению роста и даже гибели бактерий.

Устойчивость к хмелю обычно возникает из-за индуцированной экспрессии генов «множественной транспортировки препаратов» (MDT), которые представляют собой «насосы», которые распознают общую химическую сигнатуру соединений, разрушающих мембрану, а затем выкачивают их из клетки. Могут быть задействованы и другие механизмы – в нескольких работах были выявлены изменения в липидном составе плазматической мембраны, которые могут повысить стабильность. Эти изменения также происходят также в отношении алкоголя (для улучшения стабильности), поэтому неясно, имеет ли конкретное изменение какое-либо отношение к устойчивости к хмелю.

У лактобактерий обычно нет этих генов MDT, поэтому многие штаммы не справятся с хмелем в первой партии пива, но со временем становятся все более и более толерантными, поскольку они увеличивают экспрессию MDT. Общий уровень экспрессии MDT, теоретически, определяет максимальную устойчивость бактерий. В случае моих экспериментов я ищу мутантов, чьи MDT постоянно «включены» для устойчивого штамма и «выключены» для чувствительного штамма.

Устойчивость к хмелю зависит не только от вида, но и от штамма. Например, в диссертации Ф. Дж. Метнера было измерено падение pH сусла, которое началось при pH 5,55 с 3 по 14 день для нескольких штаммов L. brevis с разными уровнями IBU (7,9,11,13 и 18 IBU). Один штамм L. brevis в конечном итоге снизил до 3,8 pH на 14-й день с 7 IBU, а другой штамм снизился до 3,3 pH на 14-й день (с другими штаммами, находящимися между этими значениями). При 18 IBU pH у относительно непереносимого к хмелю штамма L. brevis снизился до 4,2, а у другого штамма – до 3,7. Как правило, чем выше IBU, тем медленнее падает pH. Интересно, что другой вид под названием L. coryniformis оказался более устойчивым к хмелю, чем L. brevis. L. coryniformis снизил pH сусла 18 IBU до 3,6 за 14 дней.

Данные Метнера представлены ниже; графики, созданны Бенедиктом Кохом. Ось Y = pH, ось X = дни.

L70: L. coryniformis

L14, L18, L22, L29, L88, L92: L. Brevis

 

Смотрите также:

Hops Antimicrobial Properties and Dry Hopping Inhibits Lactobacillus.

How hops prevent infection, by Lars Garshol.

Per Buer’s Video Demonstration of how dry hopping inhibits Lactobacillus.

 

 

Толерантность к другим видам растений

Другие виды растений также могут подавлять рост Lactobacillus. В магистерской диссертации Нади Марлен Осен из Норвежского университета естественных наук сообщается, что веточки Juniperus communis (можжевельник обыкновенной) оказывают значительное влияние на рост Lactobacillus. Испытываемые виды: L. plantarum, L. brevis и L. buchneri. Индивидуальные настои можжевельника в воде были приготовлены с использованием веточек, хвои, спелых ягод и незрелых ягод, и настои измеряли в граммах растительного материала на мл воды. Настои можжевельника широко распространены в фермерском пивоварении, а в Норвегии их называют einerlog. Ветки можжевельника, настоянные на воде, оказали наибольшее влияние на рост тестируемых видов молочнокислых бактерий, при этом L. plantarum частично подавлялись при концентрации около 0,031–1 г / мл. L. brevis частично подавлялась при 0,5–1,0 г / мл, а L. buchneri подавлялась при 0,125–1 г/мл. Хвоя можжевельника оказала очень ограниченное влияние на основе тестируемых концентраций (до 1 г / мл). Незрелые ягоды оказали очень незначительное влияние, а спелые ягоды вообще не оказали значительного влияния на рост Lactobacillus. Никаких дополнительных исследований не проводилось, чтобы определить, какие компоненты в веточках можжевельника ингибируют LAB, или каковы их концентрации.

 

Толерантность к алкоголю и сахару

Лактобактерии обычно толерантны к алкоголю и высоким уровням сахара (хотя их рост замедляется, когда содержание сахара превышает 20%, из-за осмотического давление, воздействующего на клеточную стенку). В присутствии большого количества этанола устойчивые к алкоголю штаммы заполняют свои клеточные стенки жирными кислотами, что замедляет проникаемость клеточной мембраны. Толерантность Lactobacillus к алкоголю зависит как от штамма, так и от среды для выращивания, причем толерантность к алкоголю обычно выше, когда им доступны глюкоза или крахмал. В одном исследовании, в котором изучался 31 штамм Lactobacillus, все штаммы эффективно росли при крепости 4%. Все они по-прежнему росли при крепости 10%, хотя некоторые штаммы показывали трудности в нормальном росте при крепости 10%. В целом рост замедлялся при крепости 12% (и несколько штаммов с непереносимостью алкоголя перестали расти), но у большинства все же наблюдался некоторый рост. Восемь из протестированных штаммов все еще были способны демонстрировать значительный рост при крепости 16%, и в целом большинство штаммов были способны демонстрировать хотя бы небольшой рост при крепости 16% (в большей степени при наличии крахмала и глюкозы, чем целлобиозы, лактозы или ксилозы) . В целом, виды, которые были менее устойчивы к высоким количествам этанола (10-16%), из которых: L. amylovorous (1 из 4 штаммов был особенно нетерпимым), L. hilgardii (1 штамм все еще рос с крепостью 16%, но меньше, чем другие), L. pentosus (1 штамм все еще рос в крахмальной среде, но не в глюкозной выше 10% ABV) и L. casei (большинство штаммов росли на большинстве питательных сред, но обычно меньше, чем другие виды). В целом, штаммы L. brevis и L. plantarum были более устойчивы к высоким концентрациям ABV.

 

Peyer et al. (2017) изучили влияние содержания сахара в пивном сусле на штамм Lactobacillus amylovorous. Они обнаружил, что более высокая плотность сусла увеличивает рост Lactobacillus, а следовательно, и производство молочной кислоты. Это увеличение было линейным до тех пор, пока экстракт не достиг 16 Brix (1.065 SG), после чего увеличение роста стало замедляться. Более высокий рост и большее производство молочной кислоты в сусле с более высокой плотностью, вероятно, были связаны с увеличением количества питательных веществ, а также с более высокой буферностью. Такое увеличение роста в высокоплотном сусле останавливалось при достижении 18-20 Брикс, что, вероятно, было связано с осмотическим стрессом на клетки.

 

Устойчивость к экстремальным температурам

У большинства видов Lactobacillus термическая смерть наступает при ~ 145 ° F (63 ° C). Замораживание без глицерина убьет большинство клеток, но очень небольшое количество устойчивых к холоду мутантов могут выжить (~ 1: 19: 00). В очень редких случаях некоторые штаммы были идентифицированы как чрезвычайно термотолерантные. Например, в этом патенте (см. this patent) утверждается, что штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis может подкислять молоко в течение 2,5 часов при температуре 45–65 ° C (113–149 ° F).

ПРОДОЛЖЕНИЕ СЛЕДУЕТ

 

 

Обсудим?

лактобактерии
5

Автор публикации

не в сети 10 часов

Artem1991

490
Комментарии: 8Публикации: 39Регистрация: 15-01-2021

Другие записи этого автора:

50

Какой штамм Бреттов выбрать? ...

50

Где мое помутнение? Советы как сделать Н ...

100

Лактобактерии в пиве. Часть 5. Хранение. ...

50

Лактобактерии в пиве. Часть 3. Метаболиз ...

100

Лактобактерии в пиве. Часть 2. Рост клет ...

Другие записи этого автора:

Какой штамм Бреттов выбрать? ...
Где мое помутнение? Советы как сделать Н ...
Лактобактерии в пиве. Часть 5. Хранение. ...
Лактобактерии в пиве. Часть 3. Метаболиз ...
Лактобактерии в пиве. Часть 2. Рост клет ...
Метки: , , , . Закладка Постоянная ссылка.

Обсуждение закрыто.