Лактобактерии в пиве. Часть 5.
Хранение. Культивирование. Влияние на смешанное брожение.
Заключение
Хранение
Крупные лаборатории часто хранят бактерии в лабораторном морозильнике с температурой -80C в растворе среды/глицерина (любая стандартная среда и 20-50% глицерина), однако этот вариант, как правило, непрактичен для пивоваров. Что касается высушенных Lactobacillus, таких как пробиотики или сухие дрожжи для кислых элей BlackManYeast, Брайан в своем блоге (см Bryan of Sui Generis Blog’s) заявляет, что лабораторные исследования показали, что они могут терять жизнеспособность примерно в 80 раз быстрее при комнатной температуре, чем при хранении в холоде. Поэтому рекомендуется хранить высушенные Lactobacillus при низких температурах. Кратковременное хранение жидких культур (менее 2 месяцев) также следует осуществлять в холодильнике. Прежде чем использовать несвежую культуру, подумайте о приготовлении стартера. [hide]
Жидкие культуры подвергаются стрессу из-за двух факторов: хранения в кислой среде и хранения без сахара. Хранение с сахаром создаст больше кислоты, поскольку Lactobacillus ферментирует сахар и производит кислоту, поэтому это может быть не самым идеальным вариантом несмотря на то, что Lactobacillus будут постоянно питаться. В идеале для более длительного хранения жидкие культуры Lactobacillus следует хранить замороженными с добавлением 20% глицерина или охлажденными на уклонах(“косяках”) с водой или минеральным маслом. Кроме того, существуют неофициальные данные о том, что некоторые виды могут лучше выжить при комнатной температуре. Брайан предполагает, что стабильная температура может быть более важной, чем хранение при «идеальной» температуре. Инструкции о том, как сделать уклоны в домашних условиях, способные хранить любых микробов потенциально более 2 лет (требуется скороварка), можно найти в наших публикациях здесь и здесь.
Практический вариант для пивоваров без скороварки – хранить жидкую культуру с несколькими граммами буферного химического вещества, такого как карбонат кальция (мел) или гидроксид кальция (травильная известь). Точное количество должно быть скорректировано для достижения pH примерно 4,0-6,0 для всего раствора (начните с 1 или 2 граммов на литр и при необходимости отрегулируйте).
Том Бельграно предлагает следующие дополнительные шаги для удаления остаточного сахара из раствора для хранения, а также для повышения pH:
- Сделайте колд краш, пока сусло не станет прозрачным.
- Слейте жидкость, а затем долейте ее водой (рекомендуется дистиллированной, но не обязательно).
- Снова сделайте колдкраш, пока жидкость не станет прозрачной.
- Слейте жидкость.
- Храните полученную суспензию при температуре холодильника. Небольшое понижение pH все же может произойти, но этот метод должен поддерживать pH раствора значительно выше 4,0.
Коммерческие пивовары, которые пытаются повторно использовать чистые культуры Lactobacillus для закисления в котле, часто сливают часть закисшего сусла перед его кипячением. Сусло с живыми Lactobacillus сохраняется для дальнейшего использования в будущих партиях. Вероятно, предпочтительнее холодное хранение. Этот метод может иметь свои сложности, т.к. остаточный сахар в сусле может легко привести к дрожжевому или иному загрязнения (см. 100% Lactobacillus fermentation). Хранение забуференного сусла в анаэробных условиях с pH выше 4,5 может потенциально привести к образованию ботулотоксина (Примечание переводчика: сильнейший органический яд).
Автоклавирование, тиндализация или приготовление под давлением сусла перед добавлением в него культуры Lactobacillus обеспечили бы стерильную среду, свободную от потенциальных спор ботулизма, но это может оказаться непрактичным процессом для пивовара. Можно достичь pH в районе 4,0-4,5, используя CaCO3 (мел) для буферизации pH в диапазоне, который увеличивает жизнеспособность Lactobacillus, а также делает сусло безопасным для хранения (для этого требуется больше данных в отношении необходимого количества CaCO3). Использование мела в качестве буфера аналогично использованию метода приготовления стартера по методу Самуэля Эшлиманна, описанного выше; мел должен осесть на дно емкости, и его можно будет слить.
Выращивание на агаре
Виды Lactobacillus можно вывести на чашках с агаром с помощью селективной среды, называемой Rogosa SL. Агар Rogosa SL содержит цитрат аммония, ацетат натрия, относительно низкий pH и уксусную кислоту, которые выделяют Lactobacillus, одновременно подавляя плесень и другие бактерии. Однако сама по себе эта среда не подавляет дрожжи. Если требуется подавление дрожжей, добавьте 10 мг/л циклогексимида для подавления большинства дрожжей.
Влияние на смешанное брожение
Lactobacillus могут влиять на метаболизм S. cerevisiae и производимые ими метаболиты, отвечающие за ароматы. В исследовании Dysvik et al. (2019) сравнили пиво, предварительно закисленное L buchneri, с пивом предварительно закисленным молочной кислотой, и с пивом, в которое добавили молочную кислоту после основного брожения дрожжей, и обнаружили, что молочная кислота сама по себе существенно не изменяет количество летучих ароматических соединений, продуцируемых тестируемым штаммом дрожжей (Fermentis US-05). Тем не менее, пиво, закисленное с помощью L. buchneri, содержало летучие спирты, значительно отличающиеся от пива, в которое была добавлена только молочная кислота. В частности, пиво, которое было предварительно закислено L. buchneri, в итоге содержало меньше 2-метил-1-бутанола (алкоголь, солодовые нотки), 2-метил-1-пропанол (фруктовый/винный) и фенилэтилового спирта (роза/мед). Уксусная кислота также была намного выше в пиве, закисленном L. buchneri, по сравнению с пивом с добавлением только молочной кислоты, но уксусная кислота все еще была ниже вкусового восприятия. Муравьиной кислоты было примерно в два раза больше в сусле, закисленном L. buchneri, чем в сусле с молочной кислотой или без молочной кислоты/бактерий, но муравьиная кислота полностью исчезла во всех тестируемых сортах пива во время розлива и после созревания в бутылке. Хотя в этом исследовании использовались нейтральные элевые дрожжи (US-05), а спирты/сложные эфиры во всех образцах были ниже порогового вкусового восприятия (хотя комбинации различных спиртов/сложных эфиров ниже порогового значения может все же иметь синергетическое влияние на вкус), это подтверждает отчеты пивоваров, которые сообщали, что добавление молочной кислоты в пиво и закисление пива с помощью Lactobacillus делает пиво разным, а также утверждения пивоваров о том, что предварительное закисление сусла с помощью Lactobacillus снижает дрожжевой характер итогового пива. Интересно отметить, что как пиво подкисленное L. buchneri, так и пиво с добавлением только молочной кислоты имели одинаково значительно более низкий уровень пировиноградной кислоты по сравнению с пивом, сброженным только на дрожжах, а также меньшую мутность, что указывает на то, что молочная кислота сама по себе ингибирует количество пировиноградной кислоты, продуцируемой дрожжами, а также помутнение (возможно, потому, что более низкий pH снижает образование белкового и полифенольного помутнения, или, возможно, более низкий pH увеличивает флокуляцию дрожжей).
В этом исследовании также сравнивались два предварительно закисленных сорта пива с L. buchneri, где одно было прокипячено и охмелено после закисления, а другое не кипятилось, а вместо этого смешано с охмеленным суслом перед ферментацией (жизнеспособность L. buchneri была значительно снижена, но не полностью убита в пиве, в которое добавлено охмеленное сусло, в отличии от прокипяченного сусла). Пиво, которое было смешано с охмеленным суслом, в конечном итоге имело больше всего уксусной кислоты (все еще ниже порогового значения) и самый высокий уровень сложных эфиров с фруктовым вкусом: этилгептаноата и этилоктаноата, что указывает на то, что если Lactobacillus дать возможность жить, то пиво со временем будет усложняться. Ни в одном из сортов пива не было существенных различий в отношении производства этанола или CO2, также не произошло терминального кислотного шока (вероятно, потому что крепость пива была только 4% и 3,6 pH, в отличие от 8,4% и 3,17 pH у пива, испытанного в этом исследовании terminal acid shock study by Rogers et al.). Важно отметить, что общие сенсорные различия, о которых сообщалось в этом исследовании, между пивом, закисленным с использованием L. buchneri, и пивом, закисленным с использованием молочной кислоты, были незначительными с точки зрения статистического анализа.
Закисление сусла с Lactobacillus может остановить или замедлить последовательное брожение дрожжей. Вероятно, это связано с низким уровнем pH. Присутствие молочной кислоты может изменить способ ферментации дрожжей, позволяя им потреблять разные типы сахаров независимо от того, присутствует ли в сусле глюкоза или нет, хотя было продемонстрировано, что само по себе это не является причиной остановки брожения. Peyer et al. (2017) наблюдали, что рост US-05 составлял 82% при pH 3,51 и 53% при pH 3,17. Начало брожения задерживалось на 2-4 дня (чем ниже pH, тем дольше откладывалось начало ферментации). При совместной ферментации Lactobacillus amylovorus и US-05 первоначальный рост L. amylovorus продолжался в течение 3 дней, в то время как рост US-05 задерживался. На 7-й день US-05 восстановился и продолжил рост, а рост Lactobacillus замедлился, начиная с 5-го дня. Это произошло из-за увеличения содержания этанола в результате ферментации, более низкого pH и истощения питательных веществ для Lactobacillus. Также возможно, что дрожжи выиграли от автолиза Lactobacillus, который, как предполагается, высвобождают питательные вещества, доступные дрожжам. С этим согласилась и магистерская диссертация Сантери Тенховирта. Он засеял несколько видов Lactobacillus и оставил их на 48 часов, а затем засеял Fermentis US-05. Контрольная ферментация US-05 без каких-либо Lactobacillus началась, как и ожидалось, через 20 часов, в то время как образцам, которые были предварительно подкислены Lactobacillus, потребовалось около 2 дней для начала брожения.
Ciosek et al. (2019) наблюдали противоположный эффект. Более быстрая ферментация была достигнута при внесении Lactobacillus brevis WLP672 (White Labs Inc, США) в течение 1, 2 или 3 дней перед внесением Fermentis Safale US-05. Однако через 7 дней дрожжи достигли несколько более высокой конечной плотности, и рост дрожжей был ниже, чем при внесении дрожжей до или одновременно с WLP672 L. brevis. Интересно, что наименьшая конечная плотность была достигнута, когда дрожжи и L. brevis были внесены одновременно. Это указывает на то, что некоторые виды Lactobacillus могут оказывать синергетическое действие на дрожжи, в то время как другие виды могут быть более антагонистичными по отношению к дрожжам, и что множественные стрессовые факторы, такие как сочетание низкого pH и присутствие этанола, могут препятствовать нормальной аттенюации, в отличии от ситуации с нормальным уровнем pH, который не был понижен из-за присутствия молочной кислоты. Еще одно неожиданное наблюдение было сделано Ciosek et al. (2019) для образцов, которые сначала ферментировались US-05, а затем через 1, 2 или 3 дня засеивались WLP672 L. brevis и позволяли ферментироваться в течение 7 дней: в этих образцах не было значительного падения pH из-за работы L. brevis и pH оставался равным 4,0 или выше. Этот результат указывает на то, что конкретно этот штамм не вырабатывает много молочной кислоты в присутствии этанола или после дрожжевой ферментации не остается достаточно простых сахаров (по крайней мере, за тот короткий промежуток времени, в течение которого проводились тесты). Когда L. brevis был засеян первым, потребовалось 72 часа для того, чтобы pH опустился ниже 4, но в этом случае получился самый низкий уровень pH после завершения дрожжевого брожения (~ 3,4 pH), а совместное внесение культур привело к ~ 3,7 pH. Исследователи заявили, что только когда L. brevis позволили бродить самостоятельно в течение 2-3 дней до внесения дрожжей, готовое пиво имело достаточно содержания молочной кислоты, чтобы считаться «кислым пивом» (~ 6 г / л молочной кислоты для образцов, сначала ферментированных L. brevis, по сравнению с 1,8-2,8 г / л для всех других образцов), что основано на определении Майкла Тонсмайра из книги “American Sour Beers”, в котором говорится, что кислое пиво должно иметь 3 -6 г / л молочной кислоты. Однако, в этом исследовании не было представлено никаких сенсорных данных, и не проводились измерения титруемой кислотности, а в тезисе Метнера 1987 года о Berliner Weisse сообщалось о 1-3 г/л молочной кислоты при исследовании этого немецкого кислого пива, поэтому вполне возможно, что все образцы пива в этом исследовании имели адекватный кислый вкус.
В исследовании Пейера также было обнаружено увеличение содержания диацетила и ацетоина в пиве, которое было одновременно засеяно L. amylovorus и US-05, по сравнению с пивом, закисленным в котле или закисленным при затирании. Оба эти соединения придают пиву маслянистый вкус. Обычно после первичной ферментации дрожжи восстанавливают диацетил до ацетоина, который затем превращается в бутандиол, однако в этом исследовании во время совместного брожения с Lactobacillus эти преобразования было проигнорированы. С сенсорной точки зрения, пиво, закисленное в котле в исследовании Пейера было «чище» с меньшим количеством посторонних привкусов и сливовым ароматом. Кислое затирание и пиво, закисленное в котле, имели длительное кислое послевкусие, тогда как пиво, сброженное одновременно L. amylovorus и US-05, было описано как имеющее терпкое послевкусие. Авторы предположили, что такое вяжущее послевкусие вызвано автолизом LAB-клеток, который также мог способствовать более сложному вкусовому профилю совместно сброженного пива. Исследования, посвященные тому, как Lactobacillus могут влиять на более характерные штаммы S. cerevisiae, такие как бельгийские штаммы, еще не проводились.
Проблемы с пенообразованием
Некоторые виды/штаммы Lactobacillus могут создавать все аминокислоты, которые им необходимы для роста. Эти виды известны как прототрофные. Однако большинство видов/штаммов могут производить только некоторые из аминокислот, необходимых для роста, и должны получать другие аминокислоты из окружающей среды. Эти виды известны как ауксотрофные по аминокислотам, которые они не могут производить сами. Ауксотрофные Lactobacillus могут расщеплять белки на более простые аминокислоты в окружающей их среде, чтобы потреблять аминокислоты, которые они не могут производить сами, включая пенообразующие белки в пиве, посредством процесса, называемого протеолизом. Протеолиз — это расщепление различных белков на более мелкие полипептиды или аминокислоты с использованием ферментов протеазы. Этот процесс является значительной частью при ферментации сыра и йогурта. Было обнаружено, что как гомоферментативные, так и гетероферментативные виды обладают протеолитической активностью, а степень протеолитической активности отличается от штамма к штамму и даже в большей степени от вида к виду. Эти различия, скорее всего, связаны с различиями в экспрессии генов, а также с различиями в оптимальных условиях жизнедеятельности между штаммами и видами. Виды Lactobacillus, которые были идентифицированы как расщепляющие белки (в основном в сыре или йогурте), включают Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus fermentum, and Lactobacillus plantarum. Результаты использования различных видов/штаммов, по-видимому, демонстрируют, что разные виды/штаммы меньше разрушают белки, удерживающие пивную шапку, чем другие. Например, сообщалось, что Б. Мейер говорит, что L. delbruekii обеспечивает лучшее удержание пены, чем другие виды, такие как L. brevis. Различные штаммы одного и того же вида также могут иметь разный уровень протеолитической активности.
Было показано, что протеолитическая активность некоторых видов Lactobacillus снижается при падении pH ниже 5,0. Немецкий ученый-пивовар Бургхард Хаген Мейер предложил снизить pH сусла до 4,5-4,8 с помощью молочной или фосфорной кислоты пищевого качества перед внесением Lactobacillus для борьбы с плохим удержанием пены в пиве, закисленном лактобактериями. Кроме того, ингредиенты, которые помогают удержанию пены, такие как несоложеное зерно, соложенная пшеница и солод Carafoam, были использованы для борьбы с плохим удержанием пены в пиве, закисленном Lactobacillus. Профессиональный пивовар Кристен Ингланд из Bent Brewstillery (см. Kristen England of Bent Brewstillery) протестировал экстракт хмеля Hexa Iso, введя в 4 раза больше рекомендованной дозы, и обнаружил, что он значительно увеличивает удержание пены в пиве Berliner Weisse (крепость 3,5%, pH 3,1, TA ~ 1, BU 5) с незначительной разницей во вкусе. Кристен рекомендует поэкспериментировать с более низкими дозировками, чтобы избежать слишком сильного воздействия на вкус. Другой метод, который, как сообщается, помогает удерживать пену при закисление сусла (например, закисление в котле), заключается в добавлении фунта DME на 5 галлонов сусла во время процесса тепловой пастеризации (после того, как сусло было закислено Lactobacillus). Можно также затереть специальные сырье, такое как пшеничный солод, солод чит (короткого ращения), солод carafoam или carapils, и добавить экстракт в котел во время тепловой пастеризации или кипячения. Это добавит белки, формирующие шапку, которые были потеряны во время ферментации Lactobacillus.
Фотография предоставлена Марком Хорсли. Слева – сусло с pH 5,30, а справа – сусло 4,75 pH. Оба были закислены в котле с L. delbrueckii. Оба достигли pH 3,30 после ферментации с конечной плотностью 1,7 Плато.
Кристен Ингланд из компании Bent Brewstillery по результатам исследования экстракта хмеля Hexa Iso Hop (Хмель добавлен в пиво слева, а справа ничего не добавлено)
Бактериоцины
Хотя большинство видов Lactobacillus не продуцируют бактериоцины (Прим. переводчика: специфические белки, вырабатываемые некоторыми бактериями и подавляющие жизнедеятельность клеток других штаммов того же вида или родственных видов бактерий), многие штаммы L. acidophilus хорошо известны своей способностью продуцировать бактериоцины, включая пробиотики и штаммы йогурта. Бактериоцины похожи на токсины, выделяемые некоторыми штаммами винных дрожжей (см. the toxins that some wine yeast strains produce) ; однако бактериоцины – это токсины, нацеленные на другие бактерии. Бактериоцин, который продуцирует L. acidophilus, представляет собой бактериоцин с узким спектром класса II, лактацин B («узкий спектр» означает, что этот токсин убивает очень узкий круг близкородственных грамположительных бактерий). Виды, чувствительные к токсину лактацина B, включают виды, которые генетически близки к L. acidophilus. Эти виды включают L. leichmanii, L. bulgaricus, L. delbruekii, L. lactis и L. helveticus. Виды, которые нечувствительны к токсину из-за более отдаленного генетического родства — это L. plantarum, L. casei, L. viridescens и L. fermentum. Некоторые штаммы чувствительных видов могут быть нечувствительными к токсину одних штаммов L. acidophilus, но чувствительны к другим. Токсин не влияет на большинство бактерий и дрожжей. Некоторые виды Pediococcus также могут создавать бактериоцины (см. Bootleg Biology Facebook post). Было обнаружено, что некоторые штаммы L. plantarum, обнаруженные на тибетских яках, также обладают различными уровнями производства бактериоцина. Эти штаммы продуцировали «энтероцин класса II», который подавляет рост кишечной палочки и золотистого стафилококка. Было обнаружено, что штамм Pediococcus pentocaseus также продуцирует этот энтериоцин. Было обнаружено, что один штамм L. plantarum, выделенный из чайного гриба, продуцирует бактериоцин под названием SLG10, который обладает широким спектром убивающей способности, включая воздействие как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии и предотвращает образование биопленок у других бактерий. Этот бактериоцин работает за счет увеличения проницаемости клеточных стенок конкурирующих бактерий, что заставляет клетки-мишени выделять калий и в конечном итоге погибать.
P.S. Спасибо за внимание!
[/hide]
Обсудим?
Автор публикации
Другие записи этого автора:
Балтийский портер. Пивоваренные традиции ...
