Лактобактерии в пиве. Часть 3. Метаболизм
Метаболизм
ИЗМЕНЕНИЕ рН
Типы метаболизма
Весь метаболизм Lactobacillus, включая рост[hide], состоит из потребления сахара и производства лактата (молочной кислоты). Существуют две категории метаболизма: гомолактический и гетеролактический. Гомолактическая ферментация производит только молочную кислоту, в то время как гетеролактическая ферментация производит молочную кислоту, CO2 и этанол/уксусную кислоту.
Гомолактическая ферментация
Гомолактический метаболизм описывается как катаболизм клетки, при котором одна молекула глюкозы образует две молекулы пирувата, который затем восстанавливается до двух молекул лактата (молочной кислоты). Гомолактическая ферментация позволяет сбраживать только гексозы (глюкоза, манноза и т. д.). Гомолактический метаболизм происходит по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса.
Гетеролактическая ферментация
При гетеролактическом метаболизме клетка катаболизирует одну молекулу глюкозы в одну молекулу CO2, одну молекулу глицеральдегидфосфата и одну молекулу ацетилфосфата. Молекула глицеральдегидфосфата восстанавливается до одной молекулы лактата, а ацетилфосфат восстанавливается до одной молекулы этанола (или одной молекулы уксусной кислоты вместо этанола, в зависимости от среды выращивания). Гетеролактическая ферментация позволяет сбраживать гексозы и пентозы. Гетеролактическая ферментация следует по фосфокетолазному пути, который является ответвлением пентозофосфатного пути (также называемого «фосфоглюконатным путем»). Когда для гетеролактических ферментирующих Lactobacillus доступны различные субстраты, такие как фруктоза или кислород, вместо этанола может быть получен ацетат (уксусная кислота). По крайней мере, для одного штамма L. brevis, который выполняет только гетеролактическую ферментацию, было замечено, что количество CO2, образующегося при этой ферментации в пивном сусле, было незначительным. Скорее всего, это связано с небольшим количеством сахара, потребляемого Lactobacillus.
Категории Lactobacillus
Существует три категории Lactobacillus в зависимости от типа ферментации, на которую они способны (гомолактическая, гетеролактическая или и то, и другое).
- Обязательные гомоферментативные Lactobacillus выполняют только гомолактическую ферментацию и, таким образом, производят только молочную кислоту.
- Обязательные гетероферментативные Lactobacillus выполняют только гетеролактическую ферментацию и, таким образом, производят молочную кислоту, CO2 и этанол (или иногда уксусную кислоту вместо этанола).
- Факультативно гетероферментативные Lactobacillus обычно гомолактические, если в среде много углеводов, но могут также выполнять гетеролактическое брожение, когда углеводов мало.
Разные факторы могут влиять на тип брожения (гомолактическое или гетеролактическое), который выберут факультативные гетероферментативные виды Lactobacillus . Например, L. plantarum, который является факультативно гетероферментативным видом, гомолактичен без присутствия кислорода. Однако, в присутствии кислорода он выполняет гетеролактическую ферментацию и производит уксусную кислоту.
Потребление сахаров
Lactobacillus обычно предпочитают глюкозу, фруктозу и мальтозу и не ферментирует мальтотриозу. Некоторые виды могут предпочесть одни виды сахаров другим. Например, L. plantarum сначала ферментирует глюкозу, а затем фруктозу, если она доступна. L. reuteri сначала ферментирует мальтозу, а L. brevis питается мальтозой, глюкозой и фруктозой. Дисахариды, такие как сахароза и мальтоза, проникают в клетки через определенные типы мембранных транспортных белков, называемых пермеазами, и расщепляются на моносахариды в результате фосфолиза, прежде чем они войдут в нормальный путь метаболизма углеводов. Пиковое потребление сахаров без конкуренции со стороны дрожжей обычно составляет 48 часов, при этом производится очень мало алкоголя или CO2 (около 0,10–0,30%, что намного меньше 0,5%, требуемого для безалкогольных напитков). Потребление сахаров происходит в основном в течение 48-часового периода роста, но также происходит после прекращения роста. Lactobacillus потребляет не более 0,5–1P сахаров. Высокая остаточная концентрация сахара является ограничивающим фактором роста, однако в конечном итоге низкий pH и другие побочные продукты метаболизма ослабляют и, наконец, останавливают рост Lactobacillus. Таблицу и подробное обсуждение того, какие типы сахаров сбраживают различные виды Lactobacillus, а также графики вторичных метаболитов см. Matt Humbard’s Physiology of Flavors in Beer – Lactobacillus Species blog article.
Небольшое количество штаммов Lactobacillus также может расщеплять полисахариды и крахмалы. Их называют «амилолитическими LAB». Обычно они принадлежат к виду Lb. manihotivorans, L. fermentum, L. amylovorus, L. amylophilus, L. plantarum или L. amylolyticus. Это, по-видимому, связано с геном под названием «amyA», который кодирует активность внеклеточной альфа-амилазы, а также альфа-глюкозидазы, неопуллуланазы, амилопектинфосфорилазы и мальтозофосфорилазы. Эта активность ограничивается большим количеством глюкозы, мальтозы или сахарозы. Некоторые виды могут также продуцировать бета-глюкозидазу, способную расщеплять моногликозиды, или бета-галактозидазу, которая расщепляет лактозу и другие галактоциды, но не дигликозиды. Активность как альфа-, так и бета-глюкозидазных ферментов стабильна при низких значениях pH в диапазоне 3-4, и обычно активизируется при повышении процентного содержания алкоголя до 12% и оптимальна при температуре 35-45C (в зависимости от штамма).
100% ферментация Lactobacillus
Эксперимент Ланса Шенера по 100% ферментации Lactobacillus показал, что чистые культуры WLP677, WLP672, Wyeast 5335, Wyeast 5223-PC и L. plantarum из Omega Yeast OYL-605 не смогли полностью сбродить сусло плотностью 1,037 SG. Самая сильная культура Lactobacillus, WLP677, сбродила сусло только до 1,03255 SG. Вполне вероятно, что все виды и штаммы Lactobacillus, доступные пивоварам, не могут полностью сбродить сусло. Кроме того, это исследование показало не более 0,29% ABV в 100% ферментациях Lactobacillus (свойственных WLP677). См. дополнительную информацию в разделе «100% Lactobacillus Fermentation». Если достигается более высокое сбраживание, причиной, скорее всего, является перекрестное заражение дрожжами. Магистерская диссертация Томаса Хюббе также подтверждает, что Lactobacillus сбраживает менее 10% сахаров в сусле.
Количество продуцируемого CO2 у гетероферментативных видов очень мало. Лэнс Шэнер из Omega Yeast Labs отметил, что, хотя L. brevis классифицируется как обязательный гетероферментативный вид, человеческий глаз не может обнаружить какое-либо производство CO2 в смеси Omega Yeast Lactobacillus (OYL-605). Лэнсу все еще нужно протестировать эту смесь, чтобы увидеть, производит ли она вообще какой-либо CO2. Имеются достоверные сообщения о чистых культурах Lactobacillus brevis, образующих слой пузырьков на поверхности сусла, если сусло встряхнуть. Однако ясно, что любой тип Lactobacillus, независимо от того, является ли он гетероферментативным или гомоферментативным, не может производить деку. Деку иногда можно увидеть даже при использовании коммерчески доступных культур Lactobacillus и надлежащих санитарных методов. Если дека образуется в сусле, при единственной засеянной культуре лактобактерий, это указывает на перекрестное заражение Saccharomyces или Brettanomyces либо в сусле, либо в самой культуре Lactobacillus. В дополнение к этому, гетеролактическая ферментация с помощью Lactobacillus может производить только 10-20% этанола, который может производить Saccharomyces, поэтому высокий уровень сбраживания не может быть достигнут с помощью Lactobacillus и в противном случае является признаком перекрестного загрязнения дрожжами. Измерьте плотность и, если плотность сусла упала более чем на 1P (0,004 пункта удельного веса), то это связано с дрожжевой контаминацией.
Недавние исследования солодовых напитков с молочной кислотой, также подтверждают, что Lactobacillus производит только около 0,1% алкоголя, производя «безалкогольные» ферментированные солодовые напитки. Эльке Арендт, ученый-пивовар, специализирующийся на Lactobacillus, представила свою работу на Бельгийской конференции по пивоварению 2015 года. В ней она объяснила, что LAB будет сбраживать только 0,5P сусла, независимо от плотности этого сусла. Когда в конце презентации спросили, почему Lactobacillus ферментирует только ~ 0,5P (обратите внимание, что эксперимент Шэнера показывает, что Lactobacillus ферментирует ~ 1 ° P, хотя это может быть связано с погрешностью, поскольку Шэнер выполнил этот эксперимент только один раз), учитывая, что Lactobacillus сбраживает мальтозу, и в сусле много мальтозы, Арендт ответила, что, по ее мнению, бактерии достигают максимальной плотности клеток в сусле при относительно небольшой потребности в сахаре.
Собственный эксперимент Bell’s Brewery, представленный на конференции MBAA в 2017г. Тимоти Лозеном, показал несколько более высокие уровни ABV у нескольких видов Lactobacillus. Из 7 различных видов Lactobacillus, которые были протестированы, L. bucherni (White Labs) произвели наибольшее количество алкоголя 0,64%. L. rossiae (White Labs) и L. brevis (Bell’s Brewery) произвели около 0,4%. L. delbruekii subsp. bulgaricus (ATCC # 11842) произвел около 0,5%. Остальные штаммы L. delbruekii subsp. lactis (ATCC № 12315), L. casei (White Labs) и L. plantarum (Goodbelly) дали 0,1% или ниже алкоголя.
Первичные/вторичные метаболиты
Первичные метаболиты
Молочная кислота является основным метаболитом Lactobacillus, а также CO2 и этанол/ацетат (уксусная кислота) у гетероферментативных видов. Производство кислоты является максимальным во время экспоненциальной фазы роста, но продолжается в стационарной фазе и фазе спада. Обычно чуть менее 50% производимой молочной кислоты составляет L-молочная кислота (более важна с точки зрения питания), в то время как незначительное большинство составляет D-молочная кислота. Количество продуцируемой молочной и уксусной кислот варьируется от вида к виду. Например, упомянутое исследование показало, что L. plantarum производит более чем в два раза больше молочной кислоты, чем L. brevis, а L. reuteri продуцирует немного больше молочной кислоты, чем L. brevis. L. reuteri производила примерно в два раза больше уксусной кислоты, чем L. brevis, а L. plantarum производила очень мало уксусной кислоты. Небольшое количество уксусной кислоты, продуцируемой L. plantarum в этом исследовании, объяснялось воздействием кислорода во время отбора проб, в то время как обязательные гетероферментативные виды (L. reuteri и L. brevis) производили уксусную кислоту в результате своей гетеролактической ферментации. В магистерской диссертации Сантери Тенховирта, где он закислял сусло несколькими видами Lactobacillus, не удалял воздух из свободного пространства и не пастеризовал сусло, затем производил брожение с US-05, сообщалось о 8 мг/мл молочной кислоты в образце L. rhamnosus, 7 мг/мл. в образцах L. plantarum и L. alimentarius и 5 мг / мл в образцах L. brevis и L. buchneri. Ни один из образцов не показал значительного образования уксусной кислоты, за исключением L. brevis, который продуцировал 0,3 мг/мл, и L. buchneri, который продуцировал 1,3 мг/мл.
Вторичные метаболиты
Как первичные, так и вторичные метаболиты играют большую роль в вкусовом профиле и аромате сусла, ферментированного Lactobacillus. Вторичные метаболиты — это соединения, которые напрямую не связаны с ростом организма, но часто помогают ему выжить. Вторичные метаболиты продуцируются указанными выше путями, и разные штаммы, вероятно, по-разному регулируют ферменты и продуцируют разные вторичные метаболиты. Таким образом, разные виды и штаммы могут производить самые разные вкусы и ароматы (сравните с молочной пищевой кислотой, в которой нет ни одного из этих вторичных метаболитов). Эти вторичные метаболиты являются результатом ферментации углеводов и метаболизма аминокислот. Различные виды могут иметь различные диапазоны интенсивности вкуса, особенно цитрусового вкуса; в одном исследовании закисляли сусло в течении двух дней, а затем сбродили его с помощью US-05 (закисление происходило не в котле), и цитрусовый аромат был выше для видов L. plantarum, L. alimentarius, L. brevis. и L. buchneri в сравнении с L. rhamnosus. Также сообщалось, что винный, солодовый и кислый вкусы различаются по интенсивности в зависимости от вида бактерий. В исследовании сообщалось, что L. buchneri является наиболее винным, за ним следуют (в порядке убывания интенсивности) L. brevis, L. plantarum и L. alimentarius. Кислый вкус был наиболее выражен для L. plantarum и L. alimentarius, за которыми следовали (в порядке убывания интенсивности) L. brevis, L. buchneri и, наконец, L. rhamnosus. L. rhamnosus обладал наибольшим малиновым вкусом, тогда как другие виды имели такой же уровень умеренного малинового вкуса. Все протестированные виды имели одинаковые уровни яблочного вкуса (умеренный), уксусного вкуса (слабый), маслянистого (от очень низкого до отсутствующего, хотя из сосудов для брожения никогда не удалялся кислород), горького послевкусия (слабое) и дрожжевого (слабое).
Собственный эксперимент Тимоти Лозена на пивоварне Bell’s Brewery продемонстрировал аналогичные различия вкусовых качеств сусла, скисшего разными штаммами: L. brevis из Bell’s Brewery, L. casei (White Labs), L. buchneri (White Labs), L. delbruekii subsp. bulgarius (ATCC № 11842), L. plantarum (Goodbelly) и L. rossiae (White Labs). Сусло, сброженное L. bucherni, было наиболее предпочтительным с оценкой 5,9, за ним следовали L. casei с оценкой 5,3, L. brevis с оценкой 4,9, L. plantarum с оценкой 4,6 и L. rossiae с оценкой 4,3. L. delbruekii subsp. bulgarius получил самый низкий балл по предпочтениям (1,6) и был охарактеризован как «дрянной/блевотный и вонючий». L. casei был охарактеризован как самый кислый, L. buchneri – как наиболее цитрусовый, а L. plantarum – как наиболее фруктовый. Различные штаммы также продуцировали разный диапазон титруемой кислотности и диацетила, при этом L. casei продуцировал больше всего, а L. delbruekii subsp. bulgarius самая низкая титруемая кислотность и больше всего диацетила. L buchneri произвел наибольшее количество алкоголя крепостью 0,64%. См. MBAA podcast #85 with Tim Lozen.
Другое исследование показало, что L. plantarum продуцирует значительно больше диацетила, ацетоина (вкус йогурта) и ацетальдегида, чем L. reuteri и L. brevis. Эти три соединения ассоциировались с нотками молочных продуктов и были выявленными во время сенсорного тестирования и описаны как «маслянистые», «молочные» и «йогуртовые». Некоторые LAB могут высвобождать эти соединения за счет катаболизма лимонной кислоты, которая содержится в сусле. Производство сложных эфиров обычно незначительно, хотя значительное образование сложных эфиров было обнаружено во время яблочно-молочного брожения в красных винах, и было обнаружено, что этилацетат образуется в напитках на основе солода. Ацетальдегид, полученный из L. plantarum, помогает производить пираноантоцианы, стабилизирующие красный цвет вина. Некоторые штаммы могут также выделять сивушные спирты и другие неприятные запахи. Например, упомянутое исследование обнаружило накопление n-Porponal сивушного спирта в образце L. reuteri и небольшое уменьшение изовалериановой кислоты в сочетании с небольшим увеличением гексановой кислоты у L. brevis, L. plantarum и L. reuteri (было обнаружено всего 0,25–0,32 мг/л, а порог вкуса гексановой кислоты составляет 5,4 мг / л. Гетероферментативные виды могут также продуцировать тетрагидропиридины (THP), что является причиной «мышиного» привкуса. Альдегиды (2-метил-1-пропаналь, 2-метил-1-бутаналь, 3-метил-1-бутаналь) и связанные с ними нефизельные спирты (2-метил-1-пропанол, 2-метил-1-бутанол, и 3-метил-1-бутанол) могут быть произведены из аминокислот, таких как лейцин, изолейцин и валин, для получения фруктовых ароматов. Некоторые виды, особенно большинство штаммов L. fermentum и некоторые штаммы L. delbrueckii subsp. bulgaricus, может вызывать вязкость в виде экзополисахаридов, аналогичную Pediococcus.
Dongmo et al. (2017) (2017) обнаружили 56 летучих ароматических соединений, включая различные сложные эфиры, спирты, кетоны, альдегиды, кислоты, простые эфиры, соединения серы, гетероциклические соединения, фенолы (включая гваякол и 4- винилгваяколь), терпены, лактоны и несколько неидентифицированных соединений. Ключевые соединения, производимые Lactobacillus, включают ацетальдегид (считается, что он вносит основной вклад в аромат пива, закисленного в котле), β-дамасценон, фуранеол, фенилуксусная кислота, 2-фенилэтанол, 4-винилгваякол, сотолон, метиональ, ванилин, уксусная кислота, норфуранеол, гваякол и этил-2-метилбутаноат. Ацетальдегид был самым сильным ароматическим соединением, за ним следовали пропан-1-ол и γ-додекалактон. Ацетальдегид обычно продуцируется в гораздо больших количествах (~ 23-64 мкг/л) отдельными штаммами L. plantarum, в то время как L. amylolyticus и L. brevis продуцируются только 1,5-3 мкг/л. Фактически, количество всех этих соединений значительно различались в зависимости от вида и штамма. Выбранные штаммы L. brevis имели наихудшие ароматы, в которых преобладали метиональ (вареный картофель), уксусная кислота (уксус) и норфуранеол (карамельный). Выбранные штаммы L. plantarum были идентифицированы как производящие более положительные ароматы из-за таких соединений, как β-дамасценон (яблочный / фруктовый сок), фуранеол (клубника), 2-фенилэтанол (роза / карамель) и этил 2-метилбутаноат (цитрусовые). Также были обнаружены небольшие, но значительные количества линалоола и гераниола, которые обычно являются терпенами, содержащимися в хмеле. Ваниллан образуется из феруловой кислоты некоторыми видами Lactobacillus, а также Oenococcus oeni. Некоторые штаммы Lactobacillus могут расщеплять хлорогеновые кислоты, являющиеся сложными эфирами растений, до их фенольных производных. Например, было обнаружено, что некоторые штаммы L. fermentum, L. helveticus и L. reuteri гидролизуют хлорогеновые кислоты в кофейную кислоту, которая затем может быть преобразована Brettanomyces в другие фенолы, такие как 4-винилкатехол и 4-этилкатехол.
Некоторые штаммы L. plantarum, L. brevis и Pediococcus pentosaceus могут восстанавливать гидроксикоричные кислоты, такие как п-кумаровая, кофейная и феруловая кислоты, до их производных винилфенола, подобно POF + Saccharomyces и Brettanomyces. Кроме того, было обнаружено, что некоторые штаммы L. plantarum дополнительно восстанавливают винилфенолы до этилфенолов (те же фенольные соединения, которые вырабатываются Brettanomyces) путем выделения белкового фермента, называемого VprA. Пока L. plantarum – единственный вид молочнокислых бактерий, который был идентифицирован как способный создавать этилфенолы из винилфенолов, и только определенные штаммы обладают генетической способностью делать это.
Тип зерна, из которого сделано сусло, также может играть роль в типах и количестве продуцируемых вторичных метаболитов Lactobacillus. В одном исследовании сравнивали летучие кислоты, продуцируемые пробиотическим штаммом L. plantarum (NCIMB 8826) в сусле с овсом, ячменем, соложенным ячменем и пшеницей. В сусле с овсом наблюдалось небольшое увеличение олеиновой кислоты и линолевой кислоты и их снижение в случае с пшеницей, ячменем или соложенным ячменем. В случае с соложеным ячменем наблюдалось небольшое увеличение количества активных ароматизирующих веществ, таких как фурфурол («миндальный» ароматизатор), 2-этоксиэтилацетат и изоамиловый спирт, но их не было обнаружено или обнаружено крайне мало в случае с овсом, пшеницей или несоложеным ячменем. Производство уксусной кислоты было выше в случае с соложенным и несоложенным ячменем, чем в случае с овсом и пшеницей. Многие другие органические кислоты, содержащиеся в овсе, пшенице, ячмене и соложенном ячмене предположительно поглощались L. plantarum во время брожения. В случае с ячменем обнаружили следы новых кислот, которых изначально отсутствовали в ячмене. Некоторые виды Lactobacillus, включая L. lactis и L. plantarum, производят диацетил (который может быть восстановлен до ацетоина и 2,3-бутандиола) в качестве промежуточного метаболита при потреблении сахара, цитрата и аминокислот. Однако уровни цитрата оказались довольно низкими в соложенном ячмене (выше в сорго), а образование диацетила в сусле на основе ячменя и овса оказалось очень низким.
Выдержка оказывает большое влияние на ароматы и вкусы, создаваемые Lactobacillus с течением времени, и обычно зависит от температуры окружающей среды, воздействия кислорода и побочных продуктов ферментации. Как правило, ферментация положительно влияет на сохранение некоторых ароматических и вкусовых компонентов. Другие соединения могут изменяться, вызывая изменения аромата и вкуса. Например, в одном исследовании сусло, свежесброженное L. plantarum, было охарактеризовано как «масло и мед», а после выдержки как «йогуртовое» и «кислое». В том же исследовании L. reuteri характеризовалось как «кислое» в свежем виде, и «медовое» и «острое» при выдержке. L. brevis характеризовался как «соевый соус» в свежем виде и «дрожжевой» и «сидр» после выдержки.
Многие штаммы Lactobacillus и других молочнокислых бактерий могут продуцировать танназу, которая представляет собой фермент, расщепляющий определенный класс дубильных веществ, называемых «гидролизуемыми дубильными веществами» (например, дубильная кислота). Ферментативное расщепление дубильных веществ обеспечивает Лактобактерии пищей. В процитированном исследовании штамм L. plantarum был выбран из 47 других LAB, продуцирующих танназу, как самый высокий продуцент этого фермента. Хотя оптимальный pH для танназы составляет 5-8, она также активна не менее чем на 50% при pH 3-7 и температуре 15-30°C. Танназа производится как продукт для удаления помутнения пищевых продуктов, таких как холодный чай, вино и пиво. Поэтому некоторые штаммы Lactobacillus могут положительно влиять на прозрачность пива, разрушая некоторые танины, образующие помутнение.
В итоге:
- Различные виды Lactobacillus способны ферментировать разные типы сахаров, в том числе сахара, которые Saccharomyces, возможно, не могут сбраживать.
- Все типы Lactobacillus производят разное количество и виды вторичных метаболитов (соединений, которые не требуются для жизни организма) в дополнение к первичным метаболитам, обсуждавшимся выше. К ним относятся ацетальдегид, диацетил, сивушные спирты и многие другие соединения (более подробную информацию см. Matt’s article).
- Несмотря на некоторые предубеждения пивоваров, не было доказано, что Lactobacillus вырабатывают значительный уровень масляной кислоты (см. страницу butyric acid) в присутствии кислорода или иным образом в пивном сусле. Некоторые виды могут производить небольшие количества изовалериановой кислоты в присутствии Streptococcus thermophilus или другого микроорганизма, продуцирующего альфа-кетокислоту (подробности см. Isovaleric Acid).
- Хотя Lactobacillus не ингибируются кислородом, они, как правило, не считаются организмами, производящими кислородозависимые метаболиты. Некоторые гетероферментативные виды производят уксусную кислоту, масляную кислоту (не много в сусле, но в большей степени в кисломолочных продуктах) и пропановую кислоту, но они всегда производят это анаэробным путем. Присутствие кислорода не влияет на метаболизм в целом.
- Основным неприятным запахом, который могут вызывать некоторые штаммы Lactobacillus, является ацетальдегид. Saccharomyces помогает метаболизировать ацетальдегид, вырабатываемый Lactobacillus.
[/hide]
Обсудим?
Автор публикации
Другие записи этого автора:
Балтийский портер. Пивоваренные традиции ...
